目前，可選用的顯微鏡設(shè)備和技術(shù)種類很多，本文主要是針對(duì)熟悉明場(chǎng)和熒光顯微鏡的讀者。

資料來源：《Live Cell imaging A Laboratory Manual》

作者：Robert D. Goldman，Jason R. Swedlow

01#如何評(píng)估一套顯微鏡系統(tǒng)

在選擇使用或購(gòu)買哪種系統(tǒng)時(shí)，第一個(gè)要考慮的是哪種參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)來說是最重要的：速度、靈敏度、分辨率、多波長(zhǎng)的識(shí)別能力或是細(xì)胞的活力，其中的很多參數(shù)之間是互相抵觸的，需要折中考慮。第二個(gè)需要考慮的是使用此系統(tǒng)的目的是用于某些特定的檢測(cè)，還是用于一般檢測(cè)。一般來說，硬件選擇靈活性大的系統(tǒng)更適用于特定檢測(cè)，但組裝和使用時(shí)有較高的技術(shù)要求。選擇帶有成熟軟件的系統(tǒng)比較節(jié)省時(shí)間。無論選擇什么類型的系統(tǒng)，都要先用自己的實(shí)驗(yàn)材料做測(cè)試。公司的銷售代表做設(shè)備演示時(shí)必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)使用的熒光染料和要求的放大倍數(shù)選擇合適的濾光片、激發(fā)光源和物鏡。除了感興趣的生物材料外，還應(yīng)該使用含不同染料的系列玻片，根據(jù)獲得的量化數(shù)據(jù)用于對(duì)比不同的系統(tǒng)。

顯微鏡

首先要選擇正置(從上方觀察)還是倒置(從下方觀察)顯微鏡。一般來說，觀察活細(xì)胞，要獲得高分辨率的三維圖像時(shí)，倒置顯微鏡比較有優(yōu)勢(shì)。倒置顯微鏡的載物臺(tái)使實(shí)驗(yàn)人員更便于對(duì)樣品進(jìn)行操作，也便于進(jìn)行顯微注射，并且便于使用環(huán)境可控培養(yǎng)箱。同時(shí)，倒置顯微鏡也為CCD相機(jī)的安裝提供了更好的機(jī)械穩(wěn)定性。

物鏡的選擇

物鏡鏡頭及其使用模式的選擇是影響圖像質(zhì)量的重要參數(shù)。選擇適合封固劑的顯微鏡物鏡對(duì)成像來說至關(guān)重要。顯微鏡物鏡可在空氣(通常是低放大倍數(shù))、水浸(WI)或甘油溶液(80%)、硅油或常規(guī)物鏡用油(折射率RI為1.50～1.534)中發(fā)揮作用。物鏡是顯微鏡中最重要的部件，必須定期檢查和清洗。物鏡種類和作用如下：

02#高通量顯微鏡

應(yīng)用于常規(guī)活細(xì)胞成像的大部分基本規(guī)則同樣適用于哺乳動(dòng)物活細(xì)胞的高容量篩選的顯微操作。但是由于高通量的要求，高容量篩選成像系統(tǒng)必須滿足一些額外的必要條件。大量商業(yè)化高容量篩選顯微鏡可供選擇。對(duì)于基礎(chǔ)研究環(huán)境的高通量成像系統(tǒng)最好不應(yīng)只針對(duì)于特定的應(yīng)用，而應(yīng)該具有彈性化、模塊化，能兼容基于一般熒光顯微鏡的許多其它不同檢測(cè)。我們應(yīng)特別考慮以下特征：

成像硬件的自動(dòng)化

與樣品制備過程一樣高，高通量成像需高度自動(dòng)化，包括焦點(diǎn)自動(dòng)化鑒定，快門控制的光學(xué)曝光、馬達(dá)控制熒光濾光片組、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)以及不同孔(點(diǎn))之間的顯微鏡載物臺(tái)移動(dòng)。通常固定1~3個(gè)位點(diǎn)，其它位點(diǎn)根據(jù)一定的模式由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算。基于成像和(或)硬件的自動(dòng)聚焦一般是高容量篩選顯微鏡系統(tǒng)的瓶頸，因此當(dāng)購(gòu)買到一臺(tái)高容量篩選儀器時(shí)，要特別關(guān)注此特征，尤其是在活體樣品時(shí)成像的高容量篩選顯微鏡實(shí)驗(yàn)中，依賴一套恰當(dāng)?shù)淖詣?dòng)聚焦檢測(cè)策略對(duì)獲得理想的時(shí)間分辨率是很重要的。自動(dòng)聚焦有兩種基本策略。第一是基于軟件的自動(dòng)對(duì)焦，即通過圖像來確定聚焦質(zhì)量(如在不同焦距層中確定最高變異度或優(yōu)化圖像中的聚焦物體數(shù)目)。此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是直接聚焦在感興趣的結(jié)構(gòu)上，使它們始終保持在焦點(diǎn)，而不管它們到細(xì)胞支持物的距離。然而，以圖像為參照的自動(dòng)聚焦程序通常很慢。在此方法中，在不同的焦平面要獲得多個(gè)圖像，而且在聚焦過程中活體樣品曝光量很大，增加了樣品光漂白速度，同時(shí)增加了光毒性。第二種策略是基于硬件進(jìn)行的聚焦點(diǎn)鑒定，即通過近紅外光反射來測(cè)量細(xì)胞支持物，如蓋波片位置。圖像收集的理想焦距位置可以通過使用者設(shè)定對(duì)自動(dòng)檢測(cè)出細(xì)胞支持物的位置進(jìn)行抵消，也可以通過額外再加上基于圖像的自動(dòng)聚焦程序。硬件自動(dòng)聚焦通常比圖像聚焦鑒定快，顯著降低了光漂白和光毒性。硬件自動(dòng)聚焦的缺點(diǎn)是需要額外的硬件系統(tǒng)，而且在聚焦過程中只對(duì)細(xì)胞支持物聚焦。因此在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，只有樣品位于細(xì)胞支持物同一位置時(shí)，才能對(duì)樣品精確聚焦。硬件自動(dòng)聚焦很少用于長(zhǎng)時(shí)間觀察，因?yàn)楦街?xì)胞經(jīng)常部分解離，或者在有絲分裂過程中圓形化以及胚胎在發(fā)育過程中改變形態(tài)。

穩(wěn)定性

在時(shí)程實(shí)驗(yàn)中，成像條件長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性是定量成像分析的基本條件，只有當(dāng)成像條件在短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間都能保持恒定時(shí)，在不同時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)才具有可比性，下述顯微鏡部件在高容量篩選顯微鏡實(shí)驗(yàn)中必須優(yōu)化。

激發(fā)光源。對(duì)于定量分析，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中持續(xù)穩(wěn)定的光強(qiáng)度是必要的。這可以通過使用非常穩(wěn)定的光源得以證明，如發(fā)光二極管(LED)或者監(jiān)測(cè)和調(diào)整燈溫度和光強(qiáng)度的穩(wěn)定光源。另有一選擇是自動(dòng)曝光，在不同實(shí)驗(yàn)中可保持成像強(qiáng)度的持續(xù)性。

自動(dòng)曝光。此特征確保只有幾個(gè)飽和像素并使用相機(jī)的動(dòng)態(tài)范圍。在高容量篩選實(shí)驗(yàn)中，重點(diǎn)確定最小和最大曝光時(shí)間，并將獲取的灰度值轉(zhuǎn)化為反映樣品的熒光強(qiáng)度可比值?？赏ㄟ^校準(zhǔn)選定的最小、最大強(qiáng)度的不同曝光時(shí)間和激發(fā)光強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)。

馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的x-y顯微鏡載物臺(tái)。在高容量篩選時(shí)程實(shí)驗(yàn)中，載物臺(tái)在幾百個(gè)位點(diǎn)之間重復(fù)移動(dòng)。為保證每個(gè)x-y位點(diǎn)在時(shí)間進(jìn)程中盡可能保持穩(wěn)定以避免成像分析時(shí)的問題，應(yīng)獲得nm級(jí)高重復(fù)性準(zhǔn)確性。

環(huán)境控制。溫度波動(dòng)可導(dǎo)致焦距漂移，造成可靠性成像困難，也影響細(xì)胞中很多生物過程；也就是說，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間段內(nèi)上下浮動(dòng)1℃可引起明顯變化。有不同類型的顯微鏡恒溫箱，小型的只控制培養(yǎng)皿，大型的控制整個(gè)顯微鏡鏡體。

聚焦穩(wěn)定性。自動(dòng)聚焦檢測(cè)起始后，非常穩(wěn)定的顯微鏡鏡架和恒定溫度足夠保持焦距穩(wěn)定性。如果檢測(cè)期間聚焦穩(wěn)定性不夠或者細(xì)胞沿z軸方向在細(xì)胞支持物上上下移動(dòng)，可以應(yīng)用自動(dòng)調(diào)焦系統(tǒng)來解決這個(gè)問題，但會(huì)降低時(shí)間分辨率、增加細(xì)胞毒性和光漂白，這在前面的內(nèi)容中已有討論。

兼容性

高通量篩選顯微鏡實(shí)驗(yàn)需要大量樣本，產(chǎn)生龐大的數(shù)據(jù)組。高通量篩選顯微鏡設(shè)置應(yīng)與樣本制備和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存兼容，以便優(yōu)化工作流程，并將獲取的圖像與初始樣本(siRNA/cDNA/化合物)的圖像分析結(jié)果聯(lián)系起來。對(duì)于數(shù)據(jù)存儲(chǔ)，常用文件格式不必為圖像處理轉(zhuǎn)變格式、圖像收集過程中自動(dòng)存入指定文件形式和連接到數(shù)據(jù)庫(kù)的可能性都是重要的。

編輯：hfy