基于微流體條碼標(biāo)記的空間多組學(xué)測序技術(shù)（DBiT-seq技術(shù)）

1、基于微流體條碼標(biāo)記的空間多組學(xué)測序技術(shù)（DBiT-seq技術(shù)）研究的意義

細(xì)胞中基因的表達(dá)是嚴(yán)格按照時(shí)間和空間順序發(fā)生，因此細(xì)胞類型和基因表達(dá)具有時(shí)間特異性和空間特異性。時(shí)間特異性可以通過收集不同時(shí)間點(diǎn)的樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析。但是scRNA-Seq在單細(xì)胞懸液制備過程中破壞了細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)，無法給出固態(tài)異質(zhì)化組織中細(xì)胞空間排布信息。因傳統(tǒng)的單細(xì)胞基因研究喪失了細(xì)胞的空間信息，而機(jī)體的細(xì)胞發(fā)揮作用也是與細(xì)胞所處的空間位置和環(huán)境信息有關(guān)的。空間轉(zhuǎn)錄組可以解決這些問題，通過組織切片細(xì)胞的空間信息，在保留組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，獲得細(xì)胞/基因/蛋白質(zhì)的空間表達(dá)特異性。

目前可以用于研究細(xì)胞空間位置信息的方法有兩種：“熒光原位雜化后基于光學(xué)成像”和“基于測序技術(shù)”的空間分子圖譜分析。熒光原位雜化后基于光學(xué)成像方法技術(shù)難度高，且耗時(shí)、通量低，只能分析有限的知道序列的mRNAs，不易推廣到其他組學(xué)。DBiT-seq技術(shù)的RNA逆轉(zhuǎn)錄過程是在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的，而不是釋放細(xì)胞進(jìn)行。目前該領(lǐng)域的研究空間分辨率可以達(dá)到10um，接近單細(xì)胞水平。

2、基于微流體條碼標(biāo)記的空間多組學(xué)測序技術(shù)（DBiT-seq技術(shù)）的原理

如圖1所示：基于微流體條碼標(biāo)記的空間多組學(xué)測序技術(shù)（DBiT-seq技術(shù)）的原理是利用微流控芯片技術(shù)，對切片組織進(jìn)行編碼，通過在組織中使用確定性條形碼進(jìn)行空間組測序，從而實(shí)現(xiàn)在切片組織中共同繪制mRNA和蛋白質(zhì)定位。

圖1

3、基于微流體條碼標(biāo)記的空間多組學(xué)測序技術(shù)（DBiT-seq技術(shù)）的實(shí)驗(yàn)流程

基于微流體條碼標(biāo)記的空間多組學(xué)測序技術(shù)（DBiT-seq技術(shù)）的實(shí)驗(yàn)流程一般包含如下步驟，如圖2所示：

(1)組織切片制備、優(yōu)化后固定放置在載玻片上

(2)向組織切片添加DNA抗體偶聯(lián)物的混合物（ADTs）

(3)將1片PDMS材質(zhì)的空間轉(zhuǎn)錄芯片覆蓋在組織切片上，然后放置于空間轉(zhuǎn)錄夾具，整個(gè)微流控裝置采用負(fù)壓進(jìn)樣，給切片組織標(biāo)記條碼A1,A2......A50，Am和ADTs；

(4)將前一步的PDMS空間轉(zhuǎn)錄芯片取下，更換新的1片PDMS材質(zhì)的空間轉(zhuǎn)錄芯片，進(jìn)樣方向與上一步垂直，給切片組織標(biāo)記條碼B1,B2......B50，Bn和ADTs

(5)以上步驟，完成了基于微流體條碼標(biāo)記的切片組織，然后可以進(jìn)行組織成像；組織成像之后，提取并收集組織中的cDNA，采用NGS或者其他技術(shù)進(jìn)行高通量測序。這里測序得到的基因，帶有二維（Am，Bn）的位置信息，因此可以獲得細(xì)胞/基因/蛋白質(zhì)的空間對應(yīng)信息。

圖2

4、基于微流體條碼標(biāo)記的空間多組學(xué)測序技術(shù)（DBiT-seq技術(shù)）的應(yīng)用

(1)病理學(xué)研究：通過添加基因表達(dá)維度，得出形態(tài)學(xué)結(jié)論；

(2)免疫學(xué)研究：研究免疫細(xì)胞中的基因表達(dá)特征、免疫細(xì)胞的浸潤表現(xiàn)等；

(3)發(fā)育生物學(xué)研究：用于發(fā)現(xiàn)組織背景中與形態(tài)形成有關(guān)的基因等；

(4)神經(jīng)科學(xué)研究：用于繪制大腦的各個(gè)細(xì)胞層、區(qū)分正常與患病的大腦解剖特征等；

(5)腫瘤學(xué)研究：如腫瘤微環(huán)境、腫瘤異質(zhì)性、病程進(jìn)展、癌癥形態(tài)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)等。

5、基于微流體條碼標(biāo)記的空間多組學(xué)測序技術(shù)（DBiT-seq技術(shù)）研究的夾具和芯片

所示是空間轉(zhuǎn)錄夾具ZXDBiT-seq01，該款夾具可以實(shí)現(xiàn)對空間轉(zhuǎn)錄芯片的裝配固定和負(fù)壓進(jìn)樣操作，夾具由金屬和樹脂材料加工而成，四周螺絲鎖緊，使用簡便，不易漏液。該款夾具適配圖4所示的空間轉(zhuǎn)錄芯片，材質(zhì)為PDMS，每組空間轉(zhuǎn)錄芯片包含2片芯片，從而實(shí)現(xiàn)圖2所示垂直兩個(gè)方向的標(biāo)記物（50種）進(jìn)樣操作。

所示的夾具和芯片是標(biāo)準(zhǔn)品，可根據(jù)課題研究需要定制加工更高分辨率和更多標(biāo)記條碼的產(chǎn)品。