循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）是指一組從原發(fā)性腫瘤分離并在血液中循環(huán)的稀有癌細(xì)胞。大量證據(jù)表明，CTC是標(biāo)記癌癥轉(zhuǎn)移進(jìn)展的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)外周血中CTC的數(shù)量與總生存期（OS）相關(guān)，可被視為癌癥進(jìn)展的指標(biāo)。因此，準(zhǔn)確識(shí)別和計(jì)數(shù)CTC在癌癥診斷和有效監(jiān)測(cè)中具有重要意義。

目前，分析CTC的一個(gè)主要障礙是它們相對(duì)于大量血細(xì)胞而言極為稀有。近年來(lái)，基于明場(chǎng)顯微成像的細(xì)胞形態(tài)鑒定和分類(lèi)方法因具有簡(jiǎn)單、無(wú)標(biāo)記和易于獲取的優(yōu)點(diǎn)，在CTC鑒定中表現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。然而，目前用于CTC鑒定的顯微鏡形態(tài)學(xué)方法主要依賴(lài)于載玻片上細(xì)胞的靜止成像，由于通量的限制，通過(guò)“靜止成像”方法測(cè)量的血細(xì)胞數(shù)量不足以檢測(cè)數(shù)量稀有的CTC。

據(jù)麥姆斯咨詢(xún)報(bào)道，來(lái)自鄭州大學(xué)楊瀟楠教授課題組與中科院微電子所張文昌副研究員課題組聯(lián)合提出了一種明場(chǎng)成像細(xì)胞術(shù)（BFIC）技術(shù)，以及多幀圖像關(guān)聯(lián)（MFIC）算法，作為一種潛在的無(wú)標(biāo)記CTC識(shí)別和計(jì)數(shù)方法。這種方法可以在連續(xù)記錄寬微流控通道中流動(dòng)細(xì)胞圖像的同時(shí)確定細(xì)胞類(lèi)型，并可以很容易地與大多數(shù)現(xiàn)有的CTC富集方法相結(jié)合，使其成為具有潛力的液體活檢樣本無(wú)標(biāo)記分析工具。相關(guān)研究成果以“Label-free detection and enumeration of rare circulating tumor cells by bright-field image cytometry and multi-frame image correlation analysis”為題發(fā)表于Lab on a chip期刊，其中碩士生杜自強(qiáng)和鄭大一附院李婭副主任醫(yī)師、陳冰助理研究員為論文共同第一作者，張文昌副研究員和楊瀟楠教授為共同通信作者。

為了實(shí)現(xiàn)高檢測(cè)通量和檢測(cè)精度，研究人員提出了BFIC（圖1），并設(shè)計(jì)了一種具有長(zhǎng)直通道（400μm × 30μm × 600μm）的微流控器件來(lái)引導(dǎo)細(xì)胞以層流方式通過(guò)。由于400μm的通道寬度遠(yuǎn)大于腫瘤細(xì)胞的大小，因此細(xì)胞可以平行通過(guò)，與單通道方法相比，可實(shí)現(xiàn)更高的通量和無(wú)堵塞操作，其吞吐量可高達(dá)每分鐘5萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，如果使用更高速度的相機(jī)、更大的視野可以進(jìn)一步提高吞吐量。

圖1 （a）明場(chǎng)成像細(xì)胞儀示意圖；（b）連續(xù)幀中細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)；（c）連續(xù)單幀中的細(xì)胞分類(lèi)和定位；（d）多幀關(guān)聯(lián)和計(jì)數(shù)。

采集到的圖像被傳輸?shù)接?jì)算機(jī)上經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)YOLO-V4，結(jié)合每一幀的細(xì)胞類(lèi)型和位置以及幀序列信息，得出細(xì)胞的初步分類(lèi)決策（圖1（c））。接著，研究人員通過(guò)執(zhí)行基于細(xì)胞跟蹤的MFIC算法以提高檢測(cè)精度，如圖1（d）所示。根據(jù)YOLO-V4模型給出的細(xì)胞類(lèi)型和坐標(biāo)信息，在細(xì)胞跟蹤算法下將細(xì)胞的多幀檢測(cè)結(jié)果關(guān)聯(lián)起來(lái)。

在具體試驗(yàn)過(guò)程中，為了對(duì)該方法進(jìn)行測(cè)試，研究人員選擇了三種類(lèi)型的細(xì)胞系，包括結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系的HT29、肺癌細(xì)胞系的A549和食管癌細(xì)胞系的KYSE30。獲得的紅細(xì)胞（RBCs）、白細(xì)胞（WBCs）和腫瘤細(xì)胞的圖像如圖2所示。

圖2 （a-e）RBCs（a）、WBCs（b）、HT29（c）、A549（d）和KYSE30（e）的細(xì)胞圖像，比例尺：20μm；（f）檢測(cè)細(xì)胞的尺寸分布。

經(jīng)過(guò)訓(xùn)練，細(xì)胞檢測(cè)模型能夠給出分類(lèi)決策以及位置坐標(biāo)。測(cè)試集上每一幀細(xì)胞的匯總結(jié)果如表1和表2所示。從表2可以看出，對(duì)于上述三種腫瘤細(xì)胞，單幀檢測(cè)的平均精度（AP）可以分別達(dá)到98.63%、99.04%和98.95%。

表1 測(cè)試集的混淆矩陣

表2 YOLO-V4單幀檢測(cè)在測(cè)試集上的性能評(píng)價(jià)

此外，為了定量比較單幀檢測(cè)與多幀相關(guān)檢測(cè)在識(shí)別效果方面的差異，研究人員采用了隨機(jī)單幀模式和連續(xù)5幀模式檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞系的500個(gè)腫瘤細(xì)胞。如圖3（c）所示，連續(xù)幀中CTC的識(shí)別主要表現(xiàn)在以下三種情況：True——CTC在每一幀中都被正確識(shí)別；False——非CTC（背景或其他細(xì)胞）被錯(cuò)誤識(shí)別為CTC，表現(xiàn)出假陽(yáng)性；Loss——CTC因在單個(gè)幀（例如WBC）中的錯(cuò)誤識(shí)別或因細(xì)胞粘附而漏檢而表現(xiàn)出假陰性。

在獲得每一幀的所有細(xì)胞類(lèi)型后，為了模擬單幀的檢測(cè)結(jié)果（傳統(tǒng)的靜態(tài)細(xì)胞檢測(cè)），研究人員隨機(jī)地選擇每個(gè)細(xì)胞連續(xù)5幀中的一幀，匯總了500個(gè)細(xì)胞的隨機(jī)單幀結(jié)果后，得到一個(gè)“單幀AP值”。每個(gè)“單幀AP值”代表在單幀模式下執(zhí)行一次CTC檢測(cè)。這個(gè)過(guò)程重復(fù)了100次。圖3（d）、（f）和（h）分別顯示了100次隨機(jī)試驗(yàn)中HT29、A549和KYSE30的“單幀AP值”分布。

而在多幀數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)中，單個(gè)腫瘤細(xì)胞在連續(xù)幀中被正確識(shí)別的次數(shù)記為n（1≤n≤5）。然后，研究人員使用不同的n作為閾值，對(duì)跟蹤的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行二次分類(lèi)決策，作為多幀檢測(cè)結(jié)果。之后，參考AP的計(jì)算方法，研究人員計(jì)算了多幀關(guān)聯(lián)中不同閾值下的分類(lèi)結(jié)果的AP。圖4（e）、（g）和（i）顯示了n值對(duì)三個(gè)細(xì)胞系A(chǔ)P值的影響。當(dāng)閾值n取非端點(diǎn)值時(shí)，多幀檢測(cè)的AP與單幀檢測(cè)的平均AP相比有顯著提高。

圖3 （a）連續(xù)幀的細(xì)胞圖像；（b）目標(biāo)細(xì)胞從Fn到Fn+x跟蹤過(guò)程示意圖；（c）連續(xù)幀中的CTC識(shí)別案例；（d）、（f）和（h）100次隨機(jī)試驗(yàn)中三種腫瘤細(xì)胞的“單幀AP值”分布；（e）、（g）和（i）閾值n對(duì)多幀關(guān)聯(lián)分析模式下三種腫瘤細(xì)胞AP值的影響。

大多數(shù)可用的CTC檢測(cè)技術(shù)依賴(lài)于CTC標(biāo)記物的標(biāo)記，例如上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）。然而，這些上皮生物標(biāo)志物在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程中會(huì)急劇減少，并會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記信號(hào)的丟失。為了評(píng)估EMT對(duì)上述CTC檢測(cè)方法的影響，研究人員利用HT29細(xì)胞系對(duì)EMT前后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。圖4（d）和（e）的數(shù)據(jù)表明，基于明場(chǎng)動(dòng)態(tài)顯微成像與多幀關(guān)聯(lián)算法的無(wú)標(biāo)記循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法在EMT后對(duì)CTC的平均識(shí)別精度為98.8%。因此，與依賴(lài)細(xì)胞表面特異性抗原表達(dá)的基于標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)相比，該無(wú)標(biāo)記檢測(cè)方法具有很大的優(yōu)勢(shì)，突破了僅適用于對(duì)上皮來(lái)源的CTC篩選的局限性。

圖4 （a）PMA誘導(dǎo)的HT29細(xì)胞形態(tài)和分子表達(dá)變化；（b）通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析評(píng)估E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白的表達(dá)；（c）HT29（EMT后）懸浮成像示意圖；（d）HT29（EMT后）在100次隨機(jī)試驗(yàn)中的AP分布柱狀圖；（e）多幀關(guān)聯(lián)模式下不同閾值下的AP分布。

最后，為了評(píng)估該檢測(cè)系統(tǒng)的性能，研究人員評(píng)估了其檢測(cè)限（LoD）。圖5（a）顯示了通過(guò)該細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)到的樣品中HT29細(xì)胞數(shù)與顯微鏡檢測(cè)到的HT29細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。值得注意的是，該系統(tǒng)檢測(cè)到的HT29細(xì)胞與顯微鏡檢查之間存在極好的線(xiàn)性關(guān)系（R2>0.99）。這種一致性驗(yàn)證了該方法量化真實(shí)樣本中CTC數(shù)量的能力。同時(shí)，在HT29的比例低至0.01%左右時(shí)，曲線(xiàn)的線(xiàn)性度明顯下降。因而該方法的檢測(cè)限為每10萬(wàn)個(gè)WBC檢測(cè)出10個(gè)CTC。

圖5 （a）BFIC得到的檢出限示意圖；（b）從2例結(jié)直腸腺癌（CA）患者樣本、2例肺癌（LC）患者樣本、4例食管癌（EC）患者樣本和6例健康供體（對(duì)照）樣本中檢出的CTC數(shù)量；（c）患者樣本中CTC和WBC的細(xì)胞直徑。

綜上所述，在這項(xiàng)研究中，研究人員引入了一種基于明場(chǎng)動(dòng)態(tài)顯微成像與多幀關(guān)聯(lián)算法的無(wú)標(biāo)記循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法。通過(guò)記錄微流控芯片中寬通道內(nèi)的細(xì)胞圖像，并通過(guò)深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)確定細(xì)胞類(lèi)型，達(dá)到了50000個(gè)細(xì)胞/分鐘的檢測(cè)通量，并避免了通道的堵塞。通過(guò)多幀相關(guān)分析，糾正了單幀中錯(cuò)誤或遺漏的細(xì)胞分類(lèi)結(jié)果，在不同種類(lèi)的腫瘤細(xì)胞系（HT29、A549、KYSE30）的檢測(cè)中分別達(dá)到了高達(dá)99.40%、99.52%以及99.47%的AP。該檢測(cè)方法能夠較容易地從10萬(wàn)個(gè)白細(xì)胞中檢測(cè)到多達(dá)10個(gè)腫瘤細(xì)胞，并且不受EMT的影響。另外，該方法也在8例癌癥患者的血液樣品中完成了驗(yàn)證，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1039/D2LC00190J

審核編輯 ：李倩