區(qū)室化現(xiàn)象于自然界中廣泛存在。例如，細胞依靠滲透性可調(diào)控的細胞膜和各類細胞器來區(qū)室化生物大分子并調(diào)節(jié)其擴散，從而在保證與外界物質(zhì)交換的同時能夠進行復雜的生命活動。近年來，以油包水微液滴為代表的體外區(qū)室化體系在自底向上合成生物學和高通量生物技術等領域得到了廣泛應用。然而，此類兩相系統(tǒng)隔絕了區(qū)室間和區(qū)室-環(huán)境間的物質(zhì)交換，限制了其在構(gòu)建可持續(xù)的、復雜的體外合成生物學系統(tǒng)以及高通量反應中的應用潛力。例如，細胞無法在液滴中長期存活、生長，液滴中的生化反應體系無法進行液體置換等。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近日，上?？萍即髮W與復旦大學聯(lián)合團隊在Advanced Science上發(fā)表了題為“Permeability-Engineered Compartmentalization Enables In Vitro Reconstitution of Sustained Synthetic Biology Systems”的研究論文。在該工作中，作者提出了一種在純水相環(huán)境中構(gòu)建滲透性可調(diào)的微區(qū)室化系統(tǒng)的方法，并實驗展示了該系統(tǒng)在構(gòu)建可持續(xù)的合成生物學系統(tǒng)中的巨大優(yōu)勢。該微區(qū)室化系統(tǒng)為利用高通量微流控技術生成的多層微凝膠結(jié)構(gòu)，膠囊的外層凝膠的孔徑可按需調(diào)控，進而能夠選擇性調(diào)控生物大分子和微觀顆粒（例如細菌和病毒）在微區(qū)室中的擴散。利用該系統(tǒng)，作者構(gòu)建了區(qū)室化體外無細胞蛋白質(zhì)合成體系，并通過調(diào)節(jié)區(qū)室滲透性，將轉(zhuǎn)錄-翻譯活動在空間上隔離開來，使得反應效率提高的同時，限制在微區(qū)室中的基因和酶等重要生物大分子可以循環(huán)利用。在實驗中，作者構(gòu)建了約100,000個微區(qū)室結(jié)構(gòu)，進行了多達5輪的重復表達，蛋白質(zhì)產(chǎn)量達2.2 mg/mL。此外，作者構(gòu)建了區(qū)室化活體細菌生物傳感器。其在限制工程化活體細菌擴散到環(huán)境中的同時，也杜絕了外界競爭性微生物甚至噬菌體進入?yún)^(qū)室的可能，從而極大地提升了傳感器在復雜環(huán)境中適應性，且不影響區(qū)室中工程細菌的增殖和傳感。在復雜的河流淤泥環(huán)境中，微區(qū)室化的活體細菌傳感器成功工作了高達48小時并準確檢測了環(huán)境污染物的水平。作者認為該系統(tǒng)對合成生物學系統(tǒng)在真實環(huán)境中的應用提供可能性和便利性，例如綠色生物制造、環(huán)境傳感和基于細菌的疾病治療等。

生物區(qū)室化是自然長期進化的結(jié)果。在生命系統(tǒng)中，一個典型的微區(qū)室是細胞。區(qū)室化的細胞相較于開放性體系具有更低的熵、更高的效率和更高的穩(wěn)定性。然而，細胞并不是完全與外界隔絕，其通過主動/被動的跨膜運輸與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換，與周圍細胞進行信號傳遞。多年來，研究人員一直致力于人工構(gòu)建類細胞的區(qū)室化系統(tǒng)，以用來研究自然進化（例如，天然生物區(qū)室的形成）以及進行高通量獨立的生化反應（例如，單細胞測序）。目前，被廣泛運用的微區(qū)室系統(tǒng)為油包水微液滴。該系統(tǒng)的一個主要問題為近乎完全的隔離（溶液和生物分子無法交換），從而無法用于構(gòu)建依賴物質(zhì)交換的體外系統(tǒng)。比如，細胞無法在液滴中持續(xù)生長與增殖；復雜的多步生化反應無法進行必要的溶液交換、試劑添加等。本文中，作者描述了一種滲透性可調(diào)微區(qū)室化策略（Permeability-engineeredCompartmentalization Strategy，PeCS），并展示了在構(gòu)建可持續(xù)的合成生物學反應體系中的顯著優(yōu)勢（圖 1）。作者利用高通量微流控技術生成了微米級多層水凝膠微區(qū)室。區(qū)室的外層凝膠結(jié)構(gòu)不僅可用作簡單的物理屏障，還可以實現(xiàn)類似分子篩的功能：通過調(diào)節(jié)外層凝膠的孔徑大小，整個微區(qū)室的選擇透過性得以實現(xiàn)按需調(diào)控，從而實現(xiàn)微區(qū)室內(nèi)生的物大分子甚至細胞的選擇性保留與釋放。除滲透性可調(diào)之外，PeCS在區(qū)室結(jié)構(gòu)、水凝膠材料構(gòu)成和功能化方面也具有一定的靈活性。例如：包裹磁性納米顆粒的微區(qū)室具有磁性，可通過生物實驗室通用的磁性純化的方式來便捷地對微區(qū)室進行處理。

圖1 選擇透過性可調(diào)的微區(qū)室化策略示意圖

由PeCS構(gòu)建而成的體外合成生物學系統(tǒng)具有顯著提高的持續(xù)性與穩(wěn)定性。在一項實驗中，作者構(gòu)建了基于PeCS的區(qū)室化無細胞蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)（圖2）。通過滲透性調(diào)節(jié)，該系統(tǒng)將參與轉(zhuǎn)錄活動的基因和酶限制在區(qū)室內(nèi)，生成的轉(zhuǎn)錄本RNA分子則可以自由擴散出區(qū)室，在外界環(huán)境中進行翻譯。因此，該系統(tǒng)實現(xiàn)了空間上的轉(zhuǎn)錄-翻譯分隔，具有與真核生物細胞類似的特征。在另外一項實驗中，作者基于PeCS構(gòu)建了區(qū)室化活體細菌生物傳感器，并以此為模型探究了PeCS在對基因工程化微生物（gene-modifiedmicrobe，GMM）的生物防護及適應性提升中的作用（圖3）。于此，作者提出了觀點：現(xiàn)有研究通常關注對GMM的生物防護，卻忽略了GMM由于基因編程而在環(huán)境中的適應性缺失，這導致GMM在真實環(huán)境中的廣泛應用存在困難。經(jīng)驗證，滲透性調(diào)控后的PeCS區(qū)室可以隔絕競爭性微生物甚至噬菌體，極大地提升了GMM在復雜真實環(huán)境中的適應性。目前，合作團隊正在探究PeCS體系的在人體菌群等領域的應用。

圖2 基于PeCS的區(qū)室化無細胞蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)

圖3 基于PeCS的區(qū)室化活體細菌生物傳感器

該工作由上?？萍即髮W物質(zhì)科學與技術學院劉一凡課題組、李健課題組與復旦大學生命科學學院張經(jīng)緯課題組合作完成。上?？萍即髮W物質(zhì)科學與技術學院2022屆碩士研究生李璐瑤和助理研究員張蓉為本研究論文的共同一作。同時，該研究得到了上?？萍即髮W物質(zhì)科學與技術學院李健教授、加州大學伯克利分校JayD. Keasling教授、中科院微系統(tǒng)所宓現(xiàn)強研究員、上海交通大學醫(yī)學院秦金紅教授的大力支持。此外，該研究得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、上海市浦江人才計劃和上?？萍即髮W啟動資金的支持。

上海科技大學物質(zhì)科學與技術學院劉一凡課題組（高通量生物學實驗室）致力于開發(fā)新的高通量生物技術和方法，為解析生命科學和醫(yī)學中的復雜系統(tǒng)提供新的使能技術。