高通量篩選技術(shù)已經(jīng)成為合成生物學(xué)等領(lǐng)域中突變體酶、突變體菌株篩選過程中不可或缺的技術(shù)，其應(yīng)用前景廣闊。目前，高通量篩選方法所需儀器主要依賴流式細(xì)胞儀、液滴微流控等，這些技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)突變體庫的超高通量篩選。但是，目前對(duì)于很多待分析物，仍缺乏直接的高通量篩選方法。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，為解決上述難題，近日，Biosensors and Bioelectronics在線發(fā)表了江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心和生物工程學(xué)院陳堅(jiān)院士團(tuán)隊(duì)劉龍教授課題組的研究成果“Directed evolution of diacetylchitobiose deacetylase via high-throughput droplet sorting with a novel, bacteria-based biosensor” 。該研究首先構(gòu)建了一種響應(yīng)氨基葡萄糖（GlcN）濃度的生物傳感器；接著，將其與液滴微流控高通量篩選技術(shù)結(jié)合構(gòu)建GlcN的高通量篩選方法。并且，以產(chǎn)生GlcN的關(guān)鍵酶—己丁二糖脫乙酰酶（Dac）突變體庫的篩選為例，對(duì)所構(gòu)建的篩選方法進(jìn)行了驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)了液滴內(nèi)Dac酶活性的高通量檢測(cè)，顯著提升了Dac的酶活性（圖1）。

圖1 結(jié)合生物傳感器與液滴微流控篩選Dac突變體酶示意圖

構(gòu)建響應(yīng)氨基葡萄糖的生物傳感器

該研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種可以響應(yīng)GlcN濃度的生物傳感器，該生物傳感器可以將GlcN的濃度轉(zhuǎn)化為綠色熒光信號(hào)，其熒光表達(dá)強(qiáng)度與GlcN濃度正相關(guān)，進(jìn)一步可以指示關(guān)鍵酶Dac的酶活水平。

首先，在孔板體培養(yǎng)系中，通過添加不同濃度的GlcN，驗(yàn)證了檢測(cè)菌GN1（包含有生物傳感器）對(duì)GlcN的響應(yīng)情況，證實(shí)了其可在適當(dāng)范圍內(nèi)（0-1.5g/L）線性響應(yīng)GlcN的濃度，且不會(huì)被底物乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）干擾。并且，利用表達(dá)不同Dac突變體（酶活性不同）的菌株（M0-無酶活、M1-低酶活、M2-高酶活）模擬了突變體酶的篩選過程。結(jié)果表明，含有傳感器的檢測(cè)菌株，可以通過熒光表達(dá)強(qiáng)度的高低，區(qū)分出酶活性的高低，證實(shí)了所構(gòu)建的篩選方法在實(shí)際的突變體庫篩選過程中的可行性。

圖2 孔板體系中生物傳感器對(duì)GlcN濃度、Dac酶活性的響應(yīng)情況

液滴體系下傳感器的驗(yàn)證

孔板中驗(yàn)證了篩選方法的可行性后，進(jìn)行下一步的液滴分選實(shí)驗(yàn)。按照1:1的比例，將表達(dá)Dac的菌株與含有生物傳感器的檢測(cè)菌株GN1混合培養(yǎng)，接著進(jìn)行液滴分選。圖3A顯示了各種液滴的平均熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與GlcN的濃度呈正相關(guān)。為了驗(yàn)證Dac在液滴中能否正常表達(dá)、發(fā)揮活性，分別將表達(dá)Dac突變體M0、M1和M2的菌株封裝在液滴中，孵育24小時(shí)，并加入GN1檢測(cè)菌株和底物GlcNAc，進(jìn)行熒光信號(hào)的表征。如圖3B所示，菌株M0、M1和M2的熒光信號(hào)分別為886.9 ± 79.4、1396.7 ± 133.0和1820.5 ± 192.9。結(jié)果表明，所構(gòu)建的GlcN生物傳感器同樣也適用于Dac突變體的高通量液滴分選。

圖3 液滴體系中生物傳感器對(duì)GlcN濃度、Dac酶活性的響應(yīng)情況

關(guān)鍵酶Dac的定向進(jìn)化

首先通過易錯(cuò)PCR技術(shù)，構(gòu)建關(guān)鍵酶Dac的突變體文庫。隨后，利用建立的高通量篩選方法，對(duì)含有不同Dac突變體的菌株庫進(jìn)行篩選，共篩選了約20萬個(gè)突變體；經(jīng)復(fù)篩驗(yàn)證，得到了最佳的突變體M7，其酶活由突變前的27.2 ± 1.8U/mL（M2）提升至48.6 ± 1.5U/mL（圖4）。

圖4 篩選閾值設(shè)定與酶活水平檢測(cè)

突變體的表征

通過測(cè)定M2和M7的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax。如圖5A和B所示，M7的Vmax（755.9 ± 24.0μm/s）是M2（368.8 ± 19.2μm/s）的兩倍，這與M7酶活性增強(qiáng)的結(jié)果一致。根據(jù)突變位點(diǎn)分析，M7在M2（R157T）的基礎(chǔ)上增加了S60I和F168S突變點(diǎn)，進(jìn)一步提升了酶活。

圖5 最佳Dac突變M7與突變前（M2）的比較

綜上所述，該研究開發(fā)了一種新型生物傳感器，將GlcN濃度與綠色熒光信號(hào)相關(guān)聯(lián)，并將其應(yīng)用于GlcN合成關(guān)鍵酶Dac的定向進(jìn)化。結(jié)合高通量液滴分選系統(tǒng)，成功獲得了酶活比原始突變體提高了1.8倍的Dac突變體。生物傳感器與高通量液滴分選系統(tǒng)在Dac定向進(jìn)化方面的成功應(yīng)用，進(jìn)一步助力了氨基葡萄糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

論文鏈接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36327560/

審核編輯 ：李倩