由新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎（COVID-19）已在全球迅速蔓延，世界正承受著相當(dāng)大的健康、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，快速準(zhǔn)確地識(shí)別和監(jiān)測(cè)SARS-CoV-2感染對(duì)于預(yù)防疾病傳播和最終挽救生命至關(guān)重要。由于具有同時(shí)切割靶向核酸和非靶向核酸（用作報(bào)告分子）并輸出信號(hào)的特性，CRISPR-Cas系統(tǒng)近期開始被應(yīng)用在核酸檢測(cè)中，在新型生物傳感器構(gòu)建中表現(xiàn)出了巨大的潛力。同時(shí)，電化學(xué)分析方法具有的高靈敏度、快速響應(yīng)和成本效益優(yōu)勢(shì)使電化學(xué)生物傳感器成為醫(yī)學(xué)診斷中強(qiáng)大的分析工具。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近期，深圳大學(xué)光電工程學(xué)院研究人員于Nano-Micro Letters期刊發(fā)表題為“CRISPR-Cas12a-Empowered Electrochemical Biosensor for Rapid and Ultrasensitive Detection of SARS-CoV-2 Delta Variant”的研究論文。該研究開發(fā)了一種基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的新型電化學(xué)生物傳感器，用于檢測(cè)SARS-CoV-2德爾塔（Delta）變異株。

為了增強(qiáng)傳感性能，工作電極（AuE）使用電沉積高質(zhì)量金納米顆粒修飾得到AuE-AuNPs，以增加導(dǎo)電性和活性比表面積。然后用亞甲藍(lán)單鏈DNA（MB-ssDNA）修飾AuE-AuNPs。為了穩(wěn)定的電化學(xué)信號(hào)和長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)，選擇了Cas12a蛋白來制造生物傳感器。當(dāng)生物傳感器被Cas12a-crRNA-靶標(biāo)DNA混合溶液處理時(shí)，在特異性識(shí)別靶標(biāo)DNA的作用下，Cas12a的反式切割活性激活，MB-ssDNA將從電極表面被切割。因此，AuE-AuNPs和ssDNA上的氧化還原介體（MB）之間的電子轉(zhuǎn)移在切割前后發(fā)生了變化，而這種變化可以通過電化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)和檢測(cè)。研究分別通過生物學(xué)和電化學(xué)策略檢驗(yàn)了該傳感器的可行性，并繼續(xù)傳感器的檢測(cè)限（LOD）、特異性、穩(wěn)定性以及在即時(shí)檢測(cè)（POCT）中的性能和應(yīng)用潛力。

金納米顆粒輔助CRISPR電化學(xué)生物傳感器的原理

首先將MB-ssDNA報(bào)告基因固定于修飾電極表面。基于靶標(biāo)的前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）以及靶DNA與crRNA的互補(bǔ)性，設(shè)計(jì)了導(dǎo)向Cas12a/crRNA雙鏈體，以特異性識(shí)別SARS-COV-2的靶標(biāo)DNA。在沒有目標(biāo)DNA的情況下，Cas12a-crRNA的切割活性未被激活，MB-ssDNA報(bào)告分子保留在修飾電極表面，從而產(chǎn)生了明顯的MB電化學(xué)信號(hào)。在靶標(biāo)DNA存在的情況下，Cas蛋白識(shí)別PAM序列，Cas12a的反式切割活性被激活，因此MB-ssDNA報(bào)告基因被從電極表面非特異性切割，導(dǎo)致MB的電化學(xué)信號(hào)降低。得益于金納米顆粒的大比表面積，可以將目標(biāo)識(shí)別事件轉(zhuǎn)化為電極上ssDNA報(bào)告基因的大量切割，用于設(shè)計(jì)高靈敏度的電化學(xué)核酸生物傳感器。

圖1 金納米顆粒輔助CRISPR電化學(xué)生物傳感器的原理示意圖。CRISPR電化學(xué)生物傳感器的生物可行性探究為了檢驗(yàn)基于CRISPR-Cas12a的電化學(xué)生物傳感器用于核酸檢測(cè)的可行性，在設(shè)備上檢測(cè)之前進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。如圖2A所示，設(shè)計(jì)了不同的目標(biāo)模板并將其插入pUC57質(zhì)粒中。使用瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)順式和反式切割。如圖2B所示，觀察到完整dsDNA模板的條帶（表示為“T”）。在圖2C中，只有Delta變體的DNA模板與CRISPR系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)并觀察到強(qiáng)熒光。此外，F(xiàn)AM-ssDNA-BHQ探針被用作Cas12a的報(bào)告基因，用于熒光檢測(cè)具有不同濃度（從100fM到10nM）的目標(biāo)Delta DNA，計(jì)算檢測(cè)下限約為100pM（圖 2D）。

圖2 （A）CRISPR反應(yīng)示意圖；（B）通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證反式和順式切割；（C）crRNA的特異性；（D）熒光濃度結(jié)果，灰線表示檢測(cè)限。CRISPR電化學(xué)生物傳感器的電化學(xué)可行性探究首先對(duì)生物傳感器不同階段的電化學(xué)阻抗譜（EIS）進(jìn)行了驗(yàn)證，如圖3A所示，AuE-AuNPs具有優(yōu)異的電化學(xué)電導(dǎo)率（黑色曲線）。在將MB-ssDNA固定在AuE-AuNPs上后，Ret值顯著增加至4795Ω（紅色曲線），在用Cas12a-crRNA-靶DNA混合溶液處理后，由于Cas12a的活化切割活性，大部分MB-ssDNA已被切割并與AuE-AuNPs分離導(dǎo)致Ret在藍(lán)色曲線中大幅下降（約1612Ω）。SWV如圖3B所示，當(dāng)生物傳感器用Cas12a-crRNA混合溶液處理沒有靶DNA時(shí)，在-0.27有明顯的MB的氧化還原峰（黑色曲線）；當(dāng)生物傳感器用Cas12a-crRNA與靶DNA一起處理時(shí)，MB的氧化還原峰顯著降低（紅色曲線），這進(jìn)一步證實(shí)了MB-ssDNA的成功切割和MB在生物傳感器表面的釋放。圖3C顯示了MB的氧化還原峰的SWV，靶DNA濃度范圍為100fM至10nM，其中隨著靶DNA濃度的增加，電流逐漸減小。在圖4中，電流變化（ΔI%）與目標(biāo) DNA濃度的對(duì)數(shù)得到的回歸方程為：ΔI% = 14.37lgC + 192.67，R2和LOD分別計(jì)算為0.987和50fM。

圖3 （A）電化學(xué)阻抗譜（EIS）表征；（B）方波伏安（SWV）曲線；（C）不同濃度靶DNA的SWV曲線；（D）電流變化（ΔI%）與目標(biāo)DNA濃度的對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系。

CRISPR電化學(xué)生物傳感器的特異性探究

如圖4所示，當(dāng)靶標(biāo)DNA被來自原始SARS-CoV-2病毒的核酸取代時(shí)，觀察到明顯降低的ΔI%（16.1%），這證實(shí)了crRNA靶向Delta變體的特異性。此外，MERS、H?N?、H?N?、B型流感和HRSV均表現(xiàn)出不明顯的信號(hào)變化（ΔI% < 10%），而僅來自Delta變體的靶標(biāo)DNA表現(xiàn)出顯著的電化學(xué)響應(yīng)（ΔI% = 77.9%）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明建立的電化學(xué)生物傳感器能夠以高特異性檢測(cè)SARS-COV-2 Delta變體。

圖4 AuNPs輔助E-CRISPR對(duì)SARS-COV-2 Delta變體的特異性分析。根據(jù)SWV電流計(jì)算信號(hào)變化，分別添加目標(biāo)DNA（10nM）和非目標(biāo)病毒（10nM）。

CRISPR電化學(xué)生物傳感器的即時(shí)檢測(cè)應(yīng)用探究

微型電化學(xué)工作站由智能手機(jī)連接直接控制，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可通過藍(lán)牙及時(shí)傳輸。迄今為止，絲網(wǎng)印刷技術(shù)對(duì)于SPE的制備已經(jīng)成熟，因此SPE成本非常低。POCT檢測(cè)中靶標(biāo)DNA的濃度選擇為10nM，以證明POCT微電化學(xué)工作站檢測(cè)SARS-COV-2變異株的可行性。如圖5所示，從SWV曲線得到的MB的氧化還原峰電流分別為933.05nA（不含靶標(biāo)DNA）和280.11nA（含靶標(biāo)DNA），ΔI%計(jì)算為69.97%，與從傳統(tǒng)電化學(xué)工作站獲得的相應(yīng)ΔI%相比僅10%的差異。顯然，MoECS結(jié)合微型電化學(xué)平臺(tái)可用于POCT進(jìn)行快速SARS-CoV-2 Delta變體的診斷，無需繁瑣的樣品處理。

圖5 傳感器在POCT中用于SARS-CoV-2 Delta變異檢測(cè)的示意圖、初步分析照片和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

論文鏈接： https://doi.org/10.1007/s40820-022-00888-4

審核編輯 ：李倩