多重核酸檢測(cè)在病原體鑒定、癌癥風(fēng)險(xiǎn)等應(yīng)用中具有重要價(jià)值。目前多重核酸檢測(cè)常規(guī)方法是使用不同發(fā)射波長(zhǎng)的特異性熒光探針并結(jié)合其不同的熒光強(qiáng)度來(lái)識(shí)別不同核酸靶標(biāo)，但這面臨著涉及熒光探針復(fù)雜以及綜合平衡反應(yīng)效率困難等問(wèn)題。其它方法如熒光溶解曲線分析、圖案或微球編碼等在多路復(fù)用的靈活性、準(zhǔn)確定量能力、經(jīng)濟(jì)效益方面需要改進(jìn)。

近期，深圳大學(xué)李自達(dá)課題組基于前期開發(fā)的微孔陣列芯片（Biosens.Bioelectron. 2023, 220, 114913），并結(jié)合顏色編碼和深度學(xué)習(xí)圖像分析，實(shí)現(xiàn)了高通量數(shù)字化多重核酸檢測(cè)。相關(guān)研究成果以“CoID-LAMP: Color-Encoded,Intelligent Digital LAMP for Multiplex Nucleic Acid Quantification”為題發(fā)表在Analytical Chemistry期刊上。

在該研究中，研究團(tuán)隊(duì)使用基于顏色編碼液滴的數(shù)字環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)，結(jié)合智能圖像分析（Color-Encoded，IntelligentDigital LAMP，CoID-LAMP），進(jìn)行多重核酸定量分析。CoID-LAMP通過(guò)將不同顏色的染料混入到不同的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物內(nèi)，并生成微液滴，完成顏色對(duì)引物的編碼，并將樣本微滴化處理（圖1a），然后將兩種液滴分別加載到微孔陣列芯片內(nèi)，使引物液滴與樣本液滴一對(duì)一隨機(jī)配對(duì)、融合以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（圖1b）。隨后，通過(guò)對(duì)液滴顏色進(jìn)行分析，解碼引物信息；并且利用深度學(xué)習(xí)算法模型檢測(cè)液滴內(nèi)的沉淀副產(chǎn)物，從而確定每種靶標(biāo)的液滴占用率并根據(jù)泊松分布實(shí)現(xiàn)多種靶標(biāo)的數(shù)字絕對(duì)定量。

圖1 基于顏色編碼液滴的數(shù)字環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（CoID-LAMP）流程示意圖

為準(zhǔn)確識(shí)別擴(kuò)增后含有沉淀的陽(yáng)性液滴與無(wú)沉淀的陰性液滴，研究團(tuán)隊(duì)利用YOLOv5的深度學(xué)習(xí)算法開發(fā)了一個(gè)液滴檢測(cè)模型，并驗(yàn)證了該檢測(cè)模型的準(zhǔn)確性能（平均精度均值為0.97）。

圖2 深度學(xué)習(xí)模型結(jié)構(gòu)與分析性能展示

在構(gòu)建深度學(xué)習(xí)液滴檢測(cè)模型后，研究團(tuán)隊(duì)表征了CoID-LAMP進(jìn)行數(shù)字核酸擴(kuò)增檢測(cè)的分析性能。對(duì)不同濃度的單一核酸靶標(biāo)按照CoID-LAMP方法進(jìn)行了檢測(cè)（除引物類型僅有一種外，其余按照CoID-LAMP方案執(zhí)行）。液滴檢測(cè)模型準(zhǔn)確地識(shí)別了陽(yáng)性與陰性液滴，在已知濃度為1.27 × 102 ~ 1.27 × 10? copies/μl時(shí)，CoID-LAMP的檢測(cè)結(jié)果與已知濃度具有良好的一致性。通過(guò)對(duì)該范圍內(nèi)數(shù)據(jù)線性擬合，得到CoID-LAMP檢測(cè)值與實(shí)際值之間的關(guān)系，R2為0.9986，這表明了CoID-LAMP具有優(yōu)秀的核酸定量能力。

圖3 CoID-LAMP在核酸定量中的性能表征

為了驗(yàn)證CoID-LAMP的多路復(fù)用能力，研究團(tuán)隊(duì)首先使用了生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用廣泛的熒光染料作為液滴編碼材料，通過(guò)3種激發(fā)波長(zhǎng)的熒光染料對(duì)8種引物液滴進(jìn)行了編碼，建立了8重核酸分析策略。首先利用LAMP的高度特異性去驗(yàn)證了熒光染料進(jìn)行液滴編碼-解碼的準(zhǔn)確性，即通過(guò)已知的染料去編碼引物液滴，并與單一核酸靶標(biāo)液滴進(jìn)行配對(duì)、融合、擴(kuò)增，擴(kuò)增后的LAMP陽(yáng)性液滴其對(duì)應(yīng)的熒光編碼是唯一的，且與該靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的引物熒光編碼保持一致。

圖4 使用熒光染料進(jìn)行液滴編碼和解碼準(zhǔn)確性的驗(yàn)證

在驗(yàn)證了熒光染料進(jìn)行液滴編碼與解碼的準(zhǔn)確性后，研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)CoID-LAMP的數(shù)字定量范圍，預(yù)設(shè)了已知濃度的多靶標(biāo)核酸樣本，并按照CoID-LAMP方案進(jìn)行了多靶標(biāo)定量分析，結(jié)果顯示，檢測(cè)濃度與已知濃度具有良好的一致性。

圖5 使用熒光染料編碼進(jìn)行多種核酸分析

為進(jìn)一步降低對(duì)檢測(cè)設(shè)備的需求，研究團(tuán)隊(duì)使用了明場(chǎng)的彩色染料作為液滴編碼材料，通過(guò)3種染料對(duì)4種引物液滴編碼，建立了4重核酸分析策略。同樣地，驗(yàn)證了明場(chǎng)染料進(jìn)行液滴編碼-解碼的準(zhǔn)確性。

圖6 使用彩色染料的液滴編碼和解碼準(zhǔn)確性的驗(yàn)證

最后，研究團(tuán)隊(duì)預(yù)設(shè)了已知濃度的4重靶標(biāo)核酸樣本，使用3種染料對(duì)4種引物液滴編碼，按照CoID-LAMP方案進(jìn)行了多靶標(biāo)定量分析，結(jié)果證明了基于明場(chǎng)染料的CoID-LAMP核酸定量的準(zhǔn)確性。

圖7 使用彩色染料對(duì)液滴編碼進(jìn)行多重核酸分析

綜上所述，該研究開發(fā)的CoID-LAMP技術(shù)具有檢測(cè)成本低、操作簡(jiǎn)單、對(duì)儀器要求低的優(yōu)勢(shì)，為開發(fā)適用于POCT的多重核酸檢測(cè)系統(tǒng)提供了新的解決方案。





審核編輯：劉清