01背景

高內(nèi)涵成像（High-content imaging）是一種基于生物圖像技術(shù)的高通量細(xì)胞成像篩選方法，它將自動多色熒光成像與量化數(shù)據(jù)分析相結(jié)合，以同時評估2D和3D細(xì)胞以及其他類型的生物樣本培養(yǎng)中單個細(xì)胞的多種分子特征。正因為光源技術(shù)與顯微鏡技術(shù)在過去幾十年所取得的驚人進(jìn)步，HCI才成為可能。具體來說，顯微鏡現(xiàn)在能夠通過熒光激發(fā)與自動化程序獲取大量圖像，HCI正逐漸被研究人員采用，因為它能夠在使用數(shù)百、數(shù)千甚至數(shù)百萬種新化合物處理后，對許多細(xì)胞的活性進(jìn)行無偏倚的多參數(shù)可視化和量化。

三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) ( three-dimensionalcell culture, TDCC ) 是指將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng), 使細(xì)胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長, 構(gòu)成三維的細(xì)胞-載體復(fù)合物。

三維細(xì)胞模型系統(tǒng)的高內(nèi)涵成像能比二維細(xì)胞培養(yǎng)更準(zhǔn)確地反映體內(nèi)組織生理學(xué)和疾病病理生理學(xué)的測試活性：在2D培養(yǎng)中，只有與培養(yǎng)表面接觸的一側(cè)發(fā)生細(xì)胞吸附。許多細(xì)胞從組織中分離出來并置于平面細(xì)胞培養(yǎng)表面時，會逐步變得更加扁平，分裂異常，并喪失其分化表型。而在3D培養(yǎng)中，整個細(xì)胞表面都可以發(fā)生細(xì)胞吸附。細(xì)胞吸附和伸展的程度影響其增殖、凋亡和分化功能。3D培養(yǎng)可以建立起生理上的細(xì)胞-細(xì)胞與細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，模擬天然組織的特異性，為提高候選藥物的臨床成功率提供了潛力。

當(dāng)然，三維標(biāo)本需要三維成像，因此關(guān)鍵在于達(dá)到成像系統(tǒng)主要部件（光源、顯微鏡和相機）的性能要求。

02挑戰(zhàn)

蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院生物系統(tǒng)科學(xué)與工程系的顯微鏡工程師Tom Lummen博士對實施3D活細(xì)胞成像的要求以及如何使用虹科的CELESTA激光光源滿足這些要求提供了一些見解。

“我是運營成像核心設(shè)施的顯微鏡團隊的一員。我們提供20臺高端自動顯微鏡，以滿足我們部門用戶的成像需求。我們一直在尋找這些系統(tǒng)的新功能或擴展功能。我們有非常廣泛的成像應(yīng)用，這些應(yīng)用范圍從活細(xì)胞中的小亞細(xì)胞特征，必須在短時間內(nèi)可視化，一直到需要監(jiān)測數(shù)周的非常大的3D類器官或組織培養(yǎng)物的開發(fā)。旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的需求越來越大，因為數(shù)據(jù)采集需求正朝著獲取單細(xì)胞參數(shù)的方向發(fā)展，但具有非常好的統(tǒng)計數(shù)據(jù)和/或時間分辨率。我們的倒置旋轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)面向動態(tài)樣品的活細(xì)胞觀察，但我們也看到對高3D空間通量的需求增加?！?/span>

?????????????????????????????????????????旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡允許對活體樣品進(jìn)行快速3D成像，激光束通過角錐棱鏡的小孔聚焦，平行地發(fā)送向磁盤。針孔周圍的微鏡反射一個光束回到角錐棱鏡里。每一個亞光束向后反射并通過針孔聚焦。熒光激發(fā)通過針孔聚焦，通過半反半透鏡傳送。旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡允許對活體樣品進(jìn)行快速3D成像，激光束通過角錐棱鏡的小孔聚焦，平行地發(fā)送向磁盤。針孔周圍的微鏡反射一個光束回到角錐棱鏡里。每一個亞光束向后反射并通過針孔聚焦。熒光激發(fā)通過針孔聚焦，通過半反半透鏡傳送。

?????????????????????????????????????????但利用這種技術(shù)需要在競爭需求之間取得平衡。Lummen博士描述了所涉及的一些障礙，以及它們?nèi)绾斡绊懰退膱F隊，“在顯微鏡下，在設(shè)置系統(tǒng)時總是需要權(quán)衡，你不能同時擁有所有優(yōu)勢。我們試圖追求的是專用系統(tǒng)，但我們試圖使它們盡可能保持可調(diào)諧性。我們確定了對專用倒置旋轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)的需求，該系統(tǒng)面向高通量觀察，無論是空間還是時間。這時，我們開始探索有哪些照明技術(shù)。用于高速高通量活細(xì)胞成像的合適光源（與旋轉(zhuǎn)盤的速度配對）需要高度靈活，并提供高強度，時間穩(wěn)定的光輸出，并能夠在多條光譜線之間快速切換。

03解決辦法

虹科的CELESTA激光光源被確定為此類動態(tài)活細(xì)胞旋轉(zhuǎn)盤應(yīng)用的理想照明源。Lummen博士與CELESTA分享了他的經(jīng)驗。“CELESTA與CrestOptics X-Light v3旋轉(zhuǎn)盤共聚焦掃描儀，Nikon Ti2顯微鏡和Teledyne Photometrics Kinetix sCMOS相機相結(jié)合，使我們能夠在同一時間跨度內(nèi)成像更多細(xì)胞，這可以按比例增加我們可以提供給用戶的數(shù)據(jù)吞吐量（圖1）。 圖 1. 在固定的Fucci4 HeLa細(xì)胞上進(jìn)行五色成像。圖像是使用100X，NA 1.45油浸物鏡和25 mm FOVKinetix相機拍攝的強度投影。在配備CrestOpticsX-light v3旋轉(zhuǎn)盤共聚焦掃描儀，虹科CELESTA光引擎和TeledynePhotometrics Kinetix sCMOS相機的尼康Ti2顯微鏡上記錄。Fucci4是基于熒光蛋白mTurquoise，mClover，mKO和mMaroon的細(xì)胞周期依賴性表達(dá)的細(xì)胞周期位置指示劑。圖片來源：JavierCasares，D-BSSE，蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院。

CELESTA的高強度輸出與Kinetix相機的大視場（FOV）相結(jié)合，使我們能夠在每個時間點成像更多的細(xì)胞，或者每個復(fù)合大圖像的圖塊更少。尼康Ti2和CrestOptics X-Light v3旋轉(zhuǎn)盤共聚焦掃描儀的大視場相結(jié)合，讓我們配置了雙攝像頭大視場設(shè)置（圖2）。這使我們能夠進(jìn)一步復(fù)制數(shù)據(jù)吞吐量或在動態(tài)樣品中執(zhí)行真正的并發(fā)雙通道活細(xì)胞成像。此外，虹科CELESTA的光譜輸出將我們的成像能力擴展到近紅外（nIR）。

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04虹科CELESTA光源介紹

虹科CELESTA光源的光譜輸出與CELESTA實物圖
虹科-CELESTA——面向高端成像的固態(tài)激光光源

虹科CELESTA和CELESTA quattro光引擎包括4-7個可單獨控制的固態(tài)激光光源陣列（在400-800nm范圍提供7個可選波長），并且支持快速切換。CELESTA光引擎在1.5mm直徑光纖的遠(yuǎn)端出光，其7個激光器中的每一個都能提供約1000mW的輸出功率。同樣，CELESTA quattro光引擎以相同的輸出功率規(guī)格提供了一個具有性價比的4或5線選擇。激光輸出與復(fù)雜的控制和監(jiān)測系統(tǒng)相結(jié)合，為旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、空間分辨率轉(zhuǎn)錄組學(xué)和其它高級成像應(yīng)用提供所需的高清晰度性能。

?可廣泛應(yīng)用于：細(xì)胞遺傳學(xué)；藥物研發(fā)/高內(nèi)涵篩選；基因表達(dá)分析；光遺傳學(xué)等