寫(xiě)在前面

在復(fù)雜的異質(zhì)標(biāo)本中同時(shí)識(shí)別和定位多個(gè)分子或分子組裝體的能力長(zhǎng)期以來(lái)一直是推動(dòng)熒光顯微鏡在生物和物理科學(xué)中應(yīng)用的主要優(yōu)勢(shì)。例如，自 1986 年以來(lái)，使用四種光譜不同的熒光團(tuán)鑒定 DNA 的腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤 (ATCG) 堿基，已成為大多數(shù)自動(dòng)化 DNA 測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ) [1]。

在下文中，小編為大家介紹了幾種多重?zé)晒鈾z測(cè)的方法及其特點(diǎn)，并展示利用虹科固態(tài)光源實(shí)現(xiàn)的多重?zé)晒饧夹g(shù)的應(yīng)用案例。

01 基于光譜鑒別的

多重?zé)晒鈾z測(cè)

目前，大多數(shù)多路檢測(cè)方案都基于光譜鑒別，因?yàn)榕c基于時(shí)間或空間鑒別的方法相比，它在技術(shù)上不太復(fù)雜且成本更低[2]。該技術(shù)原理主要利用雙分子標(biāo)記的熒光染料和熒光蛋白 (FP) 的光譜特性，如圖 1 所示。

在這個(gè)例子中，兩種熒光標(biāo)記的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜具有明顯的光譜重疊以及分離的區(qū)域。因此，可以通過(guò)特征的激光區(qū)域來(lái)實(shí)現(xiàn)不同熒光團(tuán)的激發(fā)。當(dāng)兩種熒光團(tuán)都存在時(shí)，比如利用475nm的激光可以實(shí)現(xiàn)兩種熒光團(tuán)同時(shí)倍激光。而只有在大于 550 nm 的波長(zhǎng)下才有可能選擇性激發(fā)一種熒光團(tuán)而不激發(fā)另一種熒光團(tuán)。通過(guò)這種對(duì)比成像方式來(lái)獲取更多特征圖像。

圖 1. Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 555 熒光團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)化熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。發(fā)射光譜重疊區(qū)域以綠色陰影顯示。灰色陰影區(qū)域表示用于獲取圖 2 中圖像 A-C 的激發(fā)帶寬 (475/28 nm)

基于圖 1 中的兩種熒光團(tuán)的光譜位置，有研究者對(duì)麂皮成纖維細(xì)胞實(shí)現(xiàn)標(biāo)記，標(biāo)記有 Alexa Fluor 488 phalloidin（肌動(dòng)蛋白）和小鼠抗 OxPhos 復(fù)合物 V + Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgG（線(xiàn)粒體）。

實(shí)驗(yàn)中使用虹科 SPECTRA 光源、Andor Zyla 5.5 sCMOS 相機(jī)和 Nikon Ti2 顯微鏡獲取的同一區(qū)域的四張 60X 熒光圖像，如圖2所示。圖像不會(huì)因串?dāng)_而退化，因?yàn)榧ぐl(fā)帶寬 (555/28 nm) 與 Alexa Fluor 488 的激發(fā)光譜沒(méi)有很大程度的相交，從而實(shí)現(xiàn)多路熒光檢測(cè)的效果。

圖 2. 使用單波段激發(fā)獲得的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架圖像與線(xiàn)粒體細(xì)胞圖像然而，光譜鑒別的方法并不能適用所有場(chǎng)景。目前光譜鑒別的最大局限在于光譜串?dāng)_，其適用范圍僅限于大約五個(gè)目標(biāo)（如圖 1 和 2）。在上面的例子中，雖然只有兩個(gè)熒光標(biāo)記，但是它們的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)跨越了整個(gè)可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍（ 400–700 nm）。而在當(dāng)前使用的數(shù)千種不同染料和 FP 中，熒光激發(fā)和發(fā)射的光譜帶寬幾乎沒(méi)有變化，較寬的光譜范圍限制了光譜鑒別的多重?zé)晒鈾z測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。目前，大規(guī)模生物系統(tǒng)的基因組和轉(zhuǎn)錄組研究可能需要同時(shí)識(shí)別和定位成百上千的分子靶標(biāo)，這種高度并行的分析超出了基于光譜鑒別的多路復(fù)用的能力。盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)出具有窄發(fā)射光譜的量子點(diǎn)納米晶體 [3]，但與有機(jī)染料相比，這種改進(jìn)的代價(jià)是熒光團(tuán)尺寸增加了一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，這反過(guò)來(lái)又阻礙了它們?cè)陔p分子標(biāo)記應(yīng)用中的實(shí)用性 。

02 基于SPECTRA光源的

多重染色成像

由于光譜鑒別技術(shù)在多重?zé)晒鈾z測(cè)的局限性，研究者們?yōu)榱藬U(kuò)大可檢測(cè)目標(biāo)數(shù)量而引入的一些新技術(shù)。

近期，有研究者提出，提出了一種直接的方法，可以從連續(xù)的全腦切片中生成一組綜合生物標(biāo)志物的讀數(shù)，表征所有主要的腦細(xì)胞類(lèi)型，范圍從亞細(xì)胞區(qū)室、單個(gè)細(xì)胞、局部多細(xì)胞生態(tài)位到每個(gè)切片的全腦區(qū)域。通過(guò)對(duì)濾光片和標(biāo)記試劑的仔細(xì)優(yōu)化，以及對(duì)原始熒光圖像數(shù)據(jù)的串?dāng)_和非特異性標(biāo)記進(jìn)行校正的穩(wěn)健解混算法的應(yīng)用，已經(jīng)證明了腦組織的 10 色多重成像 [5]。

圖3 多重 IHC 染色和多光譜廣域落射熒光成像設(shè)備[5]

該成像平臺(tái)在從紫外到近紅外（350-800?nm）的整個(gè)可用光譜范圍內(nèi)，充分利用了廣泛選擇的光譜兼容熒光團(tuán)的可用性。10 色多光譜成像所需的寬視場(chǎng)落射熒光顯微鏡組件包括配備高分辨率物鏡、高靈敏度數(shù)碼相機(jī)、廣譜光激發(fā)源和 10 個(gè)獨(dú)立的激發(fā)/二向色/發(fā)射濾光片組經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可檢測(cè)多達(dá) 10 種常用或定制的光譜兼容熒光報(bào)告分子，具有最小的光譜串?dāng)_。

圖 4. SPECTRA Light Engine 的光譜輸出經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可選擇性激發(fā)用于 10 重免疫熒光檢測(cè)的熒光染料 [5]。

圖 4顯示了針對(duì)本技術(shù)中使用的熒光染料面板的選擇性激發(fā)而優(yōu)化的虹科SPECTRA 光源 的光譜輸出。光源結(jié)合了 LED、光管和激光器，以實(shí)現(xiàn)所需的光譜激發(fā)分布和所需的光功率。使用相同的熒光染料面板和濾光片配置，可以通過(guò)連續(xù)幾輪的剝離、重新標(biāo)記和成像來(lái)增加多路復(fù)用的程度。

通過(guò)五個(gè)循環(huán)的剝離、10 色重新標(biāo)記和成像，以及專(zhuān)業(yè)的隔離算法與深度學(xué)習(xí)，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在整個(gè)大鼠腦冠狀切片中同時(shí)定位 50 個(gè)生物標(biāo)志物目標(biāo) [5]。

03 基于CELESTA光源的

MERFISH技術(shù)

通過(guò)將空間和時(shí)間維度添加到基于光譜辨別的多路復(fù)用中，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出能夠同時(shí)識(shí)別和定位成百上千個(gè)生物分子目標(biāo)的多路復(fù)用技術(shù) [6]。在相當(dāng)大的程度上，這些技術(shù)利用核酸雜交既可以識(shí)別 DNA 和 RNA 分子靶標(biāo)，也可以作為產(chǎn)生熒光染料順序排列的模板。?

圖 5. 用于基因表達(dá)分析的分子條形碼掃描原理。帶有激發(fā)和發(fā)射濾光片的掃描儀可識(shí)別由藍(lán)色、綠色、黃色和紅色圓圈表示的 4 種染料，從探針位置 1 到 6 讀取熒光信號(hào)，以揭示雜交核酸靶標(biāo)的編碼身份。基于此原理的MERFISH（多重誤差魯棒熒光原位雜交）技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模多重單分子成像，能夠同時(shí)測(cè)量單細(xì)胞中成百上千個(gè)目標(biāo) RNA 的拷貝數(shù)和空間分布 [9]。在 MERFISH 中，目標(biāo)相關(guān)的條形碼被迭代讀取。首先，編碼寡核苷酸探針與目標(biāo) RNA 雜交。然后連續(xù)添加熒光染料標(biāo)記的讀出寡核苷酸探針，在單分子水平上進(jìn)行空間定位，然后熄滅。讀出探針必須專(zhuān)門(mén)與編碼探針雜交，而不是與細(xì)胞核酸雜交。編碼探針身份在連續(xù)成像周期中累積，如果通過(guò)讀出探針的雜交檢測(cè)到編碼探針，則分配二進(jìn)制位值“1”，否則分配“0”值。通過(guò)在每個(gè)循環(huán)中同時(shí)檢測(cè)具有光譜不同熒光標(biāo)記的讀出探針，可以減少雜交 + 成像循環(huán)的數(shù)量，從而減少完成數(shù)據(jù)采集所需的時(shí)間。圖 5. CELESTA 激光引擎光譜輸出針對(duì) MERFISH 多路復(fù)用單分子成像進(jìn)行了優(yōu)化。

MERFISH 需要與典型 sCMOS 相機(jī)傳感器的尺寸 (~200 mm2) 相匹配的高強(qiáng)度、空間均勻的照明場(chǎng)。為了滿(mǎn)足這一要求，研究者們?cè)陲@微鏡中安裝了一個(gè)與虹科 CELESTA 光源（圖 5）的光纖輸出耦合的專(zhuān)用臨界落射器，通過(guò)具有高數(shù)值孔徑的高放大倍率物鏡在樣品平面上提供每平方厘米1-10W的光強(qiáng)度。

顯然，高度平行的熒光標(biāo)記生物分析，那些需要多路復(fù)用超過(guò)簡(jiǎn)單光譜辨別能力的分析，可以通過(guò)明智地選擇熒光、濾光片、微調(diào)激發(fā)照明和智能算法來(lái)實(shí)現(xiàn)。分子條形碼等巧妙的標(biāo)記策略也可用于各種生物樣品，以增強(qiáng)來(lái)自高度復(fù)雜組織標(biāo)本的生物分子信息的光譜辨別和空間分布。

在虹科固態(tài)光源的純凈、明亮、穩(wěn)定的照明性能的支持下，能夠有效克服可見(jiàn)波長(zhǎng)內(nèi)定義的歷史限制，能夠?qū)崿F(xiàn)最高通量、最優(yōu)質(zhì)量的多路復(fù)用熒光檢測(cè)效果。

虹科固態(tài)光源介紹

虹科SPECTRA

虹科SPECTRA固態(tài)光源擁有8個(gè)可單獨(dú)控制的固態(tài)光源，提供了空前的性能。每個(gè)色帶在液體光導(dǎo)的末端提供大約半瓦的光功率。組成光源包括LED，專(zhuān)利的冷光燈和激光光源。

光源的輸出通過(guò)內(nèi)部集成的帶通濾光片優(yōu)化。光輸出端口具有內(nèi)置適配器，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的3mm直徑的液態(tài)光導(dǎo)LLG連接到顯微鏡和其他生物分析儀器。為滿(mǎn)足需要快速（10us）切換的應(yīng)用，所有八個(gè)信號(hào)源均提供了TTL觸發(fā)輸入。

虹科CELESTA

虹科 CELESTA 和 CELESTA quattro 光源包括4-7個(gè)可單獨(dú)控制的固態(tài)激光光源陣列（在400-800nm范圍提供7個(gè)可選波長(zhǎng)），并且支持快速切換。CELESTA 光引擎在1.5mm直徑光纖的遠(yuǎn)端出光，其7個(gè)激光器中的每一個(gè)都能提供約1W的輸出功率。

同樣，CELESTA quattro 光源以相同的輸出功率規(guī)格提供了一個(gè)具有性?xún)r(jià)比的4或5線(xiàn)選擇。激光輸出與復(fù)雜的控制和監(jiān)測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，為旋轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡、空間分辨率轉(zhuǎn)錄組學(xué)和其它高級(jí)成像應(yīng)用提供所需的高清晰度性能。