細胞通過限制性三維遷移可導致核包膜完整性喪失、DNA損傷和基因不穩(wěn)定。盡管有這些有害的現(xiàn)象，暫時暴露在封閉環(huán)境中的細胞通常不會死亡。目前，這是否也適用于受到長期禁錮的細胞仍不清楚。近日，來自美國奧本大學的Panagiotis Mistriotis教授團隊進行了通過下調YAP活性限制P53過度激活以促進細胞在封閉中存活的相關研究。研究成果以“Downregulation of YAP Activity Restricts P53 Hyperactivation to Promote Cell Survival in Confinement”為題發(fā)表在Advanced Science期刊上。

在該項研究中，研究人員采用了光刻和微流控技術制造一個高通量的器件，該器件規(guī)避以前細胞封閉模型的限制，并能在生理相關尺度的微通道中長期培養(yǎng)單細胞。這項研究的結果表明，連續(xù)暴露在嚴格的封閉環(huán)境中會引發(fā)頻繁的核包膜破裂，反過來又會促進P53的激活和細胞凋亡。遷移的細胞最終會適應密閉，并通過下調YAP活性來逃避細胞死亡。YAP活性的降低是封閉誘導YAP1/2轉位到細胞質的結果，抑制了核包膜破裂的發(fā)生率，并廢除P53介導的細胞死亡。總之該研究建立了先進、高通量的生物模擬模型，以更好理解健康和疾病中的細胞行為，并強調環(huán)境線索和機械傳導途徑在調節(jié)細胞生命和死亡中的關鍵作用。

光刻和微流控技術在生理尺寸微通道中禁錮細胞

將微流控技術與光刻圖案化結合起來，從而能夠研究長期三維封閉如何影響細胞行為。研究人員首先建立了一個平行微通道陣列，其尺寸模仿體內遷移細胞遇到的通道狀軌道或微血管的大小。與這些微通道垂直的是兩個較大的、類似于二維的通道，作為細胞和培養(yǎng)基的儲存器。通過應用PRIMO光刻技術和光活化試劑PLPP，降解了襯在微通道壁上的防粘層，并使用ECM蛋白涂覆。接著將細胞引入微流控器件，在入口和出口之間產生一個壓力差，促使細胞流經最下層的二維類通道。盡管細胞未能粘附在用PLL-mPEG-SVA處理的通道上，但它們卻附著在膠原蛋白I光刻圖案微通道的入口附近。在趨化作用下，細胞進入用光刻的微通道。接下來，研究人員量化了細胞進入后留在微通道內的細胞比例。結果發(fā)現(xiàn)，細胞在光刻圖案微通道中的夾帶效率達到80% ~ 95%，并且與幾何形狀無關。相比之下，膠原蛋白I涂層的器件，有利于細胞通過微通道遷移?？傊?，將微流控技術與光刻技術相結合，可以開發(fā)出一種平臺技術，實現(xiàn)在規(guī)定尺寸微通道中對單細胞進行長期培養(yǎng)。

圖1 利用光刻技術在微通道壁上沉積ECM

封閉環(huán)境中的細胞分裂和死亡

接下來，對部分、全部和橫向封閉的微通道內的細胞分裂和存活率進行量化。作為二維對照，采用橫截面積為400μm × 50 μm的膠原蛋白I涂層通道。在封閉的微環(huán)境中，相對于二維對照，18小時內分裂的細胞比例減少。在細胞禁錮的后期細胞增殖減少。同時，大多數(shù)未分裂的細胞在封閉60小時后顯示其縱向面積增加。雖然細胞在非封閉和部分封閉微環(huán)境中保持較高的活力，但垂直而非橫向的封閉會誘發(fā)細胞死亡。通過監(jiān)測與FITC共軛的牛血清白蛋白（BSA）的擴散，驗證了垂直封閉的細胞可以獲得營養(yǎng)物質。表明細胞系之間對封閉誘導的細胞死亡的敏感性是不同的。為了將本文研究結果從基于PDMS的微機制擴展到更易受外界影響的生物環(huán)境，使用具有不同硬度和孔徑的三維膠原蛋白水凝膠基質。將HT-1080纖維肉瘤細胞包裹在柔軟的、平均孔徑1.5 μm的水凝膠中，在3天的培養(yǎng)中支持細胞增殖、擴散和生存。相反，僵硬的水凝膠與減少的孔徑損害了細胞伸長，阻礙了細胞生長，并促進細胞死亡。這些發(fā)現(xiàn)表明，細胞死亡可能發(fā)生在具有生理學相關力學的封閉微環(huán)境中。

圖2 三維封閉調控細胞分裂和細胞死亡

垂直封閉中P53激活引發(fā)細胞凋亡

為了確定封閉促進細胞死亡的機制，該研究分析了部分和垂直封閉微通道中皮膚成纖維細胞或HT-1080細胞表型。垂直封閉成纖維細胞在禁錮1或3天后有60%的膜出血。在垂直封閉的HT-1080細胞中，膜出血的程度更加明顯。在禁錮一天后，80%的細胞顯示出血的表型。在部分封閉的微通道中，無論細胞類型如何，都沒有膜出血現(xiàn)象。用熒光延時監(jiān)測HT-1080細胞表達肌動蛋白和組蛋白2B情況。結果發(fā)現(xiàn)碎裂細胞核的百分比隨著時間的推移而增加，18小時后達到20%。大多數(shù)垂直封閉的細胞在細胞死亡期間增加了caspase-3/7的活性。相反，保持活力的垂直封閉細胞或部分封閉的細胞未能激活這些蛋白酶。這些數(shù)據顯示，垂直封閉主要通過誘導細胞凋亡來保證細胞的活力。當核包膜完整性受到損害時，會滲漏到細胞質中。與存活的細胞相比，最終死亡的夾層細胞中NERs的嚴重程度更為明顯。相反，在支持細胞存活的部分或橫向封閉的微通道中，NER的頻率和經歷NER細胞的比例明顯減少?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明，垂直封閉促進了核包膜完整性的頻繁喪失，反過來又誘導了P53依賴的DNA損傷反應，從而使細胞凋亡。

圖3 垂直封閉中P53激活引發(fā)細胞凋亡

YAP進入細胞質通過降低NER和P53活性發(fā)生率促進細胞對封閉環(huán)境適應

圖4 封閉誘導的YAP進入細胞質中，降低YAP的活性

一部分成纖維細胞和HT-1080細胞能夠適應垂直封閉并存活。此外P53活性在第3天有所下降，這表明存在一種機制來限制P53依賴的促凋亡途徑激活。使用免疫熒光法，發(fā)現(xiàn)在細胞進入垂直而非部分封閉的微通道后，機械傳導因子YAP1立即轉入HT-1080細胞和成纖維細胞的細胞質中。禁錮24小時后，還觀察到YAP1的細胞質定位增加。YAP1和YAP2可以通過與TEAD轉錄因子相關聯(lián)來調節(jié)基因表達。因此，將YAP/TEAD-RE（ACATTCCA）亞克隆到LVDP載體，以量化YAP的轉錄活性。YAP轉錄活性的量化顯示，在細胞進入微通道后24小時，相對于部分封閉的成纖維細胞，垂直封閉的成纖維細胞顯示出YAP依賴的基因表達減少。在攜帶突變體P53基因的MDA-MB-231細胞中也有類似的減少，表明P53沒有介導觀察到的YAP活性下降。接下來研究了禁閉如何改變YAP的亞細胞分布。使用Exportin 1抑制劑處理部分和垂直封閉的細胞。核包膜破裂參與觸發(fā)YAP轉位到細胞質，抑制NER的側向封閉將促進YAP的核累積。這些數(shù)據表明，RhoA/ROCK途徑控制YAP核上質運輸，與NER無關，可能是通過抑制Exportin 1介導的YAP1核出口。

圖5 細胞質中YAP積累支持細胞在封閉狀態(tài)下的存活

以上研究表明YAP到細胞質出口可以由活躍的核出口機制調節(jié)，而不是由NER調節(jié)。YAP的構成性激活已證明會損害核膜的完整性。這些發(fā)現(xiàn)促使研究人員假設，禁閉誘導YAP進入細胞質中，抑制YAP依賴的轉錄活動，最終減少了NER、P53活性和細胞死亡的頻率。與這一假設一致，該研究證明垂直封閉的HT-1080細胞仍然存活，相對于那些死亡的細胞，EGFP-YAP2的核水平降低。此外，該研究發(fā)現(xiàn)用siYAP1處理的垂直封閉的HT-1080細胞的細胞核相對于對照細胞的細胞核破裂頻率較低。YAP1敲除也抑制發(fā)生NER成纖維細胞的比例，并減少了P53的激活。這種干預促進兩種細胞類型在垂直封閉中的生存能力。相反，用針對LATS2的siRNA轉染HT-1080細胞和皮膚成纖維細胞，使YAP磷酸化和失活，明顯增加YAP1的核水平，并加劇封閉誘導的細胞死亡?？偠灾?，該研究數(shù)據表明，YAP活性的下調有助于細胞對封閉適應，從而使細胞存活。

綜上所述，該研究利用微流控實驗和成像工具，證明了封閉的幾何形狀和等級控制著遷移細胞的生長和生存。在封閉微環(huán)境中，腫瘤抑制因子P53是控制細胞存活和死亡的關鍵因素。YAP在調節(jié)NER和P53活性中具有關鍵作用，介導細胞對封閉環(huán)境的適應。該研究對癌癥治療有更廣泛的意義，因為它產生了關于遷移腫瘤細胞如何感知和應對長期三維封閉的新理念。已有研究表明，循環(huán)腫瘤細胞被困在封閉微血管中與細胞活力的降低有關。因此，制定策略以提高細胞對封閉反應能力可能是抑制血管內腫瘤細胞生存的一種新方法。

審核編輯：劉清