近年來，腫瘤早期診斷研究已經(jīng)取得了顯著進展。其中核酸標記物在液體活檢中發(fā)揮著關鍵作用，能夠提供關于治療響應、腫瘤復發(fā)以及腫瘤內(nèi)異質(zhì)性等方面的重要信息。數(shù)字DNA擴增技術作為一種可靠且準確的液體活檢工具，能夠在不依賴標準參考物的情況下對微量核酸分子進行絕對定量。為了實現(xiàn)數(shù)字DNA擴增的單分子分辨率，需要將檢測樣本分隔到系統(tǒng)內(nèi)的獨立區(qū)室進行擴增，并通過計數(shù)和分析陽性區(qū)室的數(shù)量和熒光強度來確定目標基因的拷貝數(shù)。

目前，數(shù)字PCR中的分區(qū)實現(xiàn)主要依賴于基于腔室的微流控技術和基于液滴的微流控技術。基于腔室的方法通過泵或閥門將樣本引入數(shù)萬個反應腔室的陣列中。而基于液滴的方法則通過注射泵、離心力或氣動力生成反應腔室，從而可以創(chuàng)建理論上無限數(shù)量的腔室，提供了更高的靈活性和更廣的動態(tài)范圍，以提高檢測能力。然而，現(xiàn)有的數(shù)字PCR儀往往依賴于昂貴的商業(yè)系統(tǒng)或?qū)Ｓ迷O備，導致成本居高不下。此外，檢測過程中需要在不同設備之間進行轉(zhuǎn)換，存在交叉污染的風險，并且液滴損失可能導致目標定量低估。

因此，無論是市場還是臨床，都迫切需要一種集成化的微流控平臺，以滿足數(shù)字DNA擴增在液體活檢中的用戶需求，推動液體活檢在癌癥診療中的廣泛應用，并為個性化醫(yī)療和治療監(jiān)測提供更可靠的工具。該平臺應具備獨立區(qū)室進行擴增的能力，并能夠通過計數(shù)和分析陽性區(qū)室的數(shù)量和熒光強度來確定目標基因的拷貝數(shù)。同時，該平臺應減少操作過程中交叉污染的風險和液滴損失導致的目標定量低估。此外，該平臺應具備較高的靈活性和更廣的動態(tài)范圍，以適應不同的檢測需求。

為實現(xiàn)上述目標，近期，香港城市大學生物醫(yī)學系、香港大學臨床腫瘤學系、晶準醫(yī)學的聯(lián)合科研團隊發(fā)表了一篇利用集成化多功能的液滴微流控技術平臺實現(xiàn)數(shù)字DNA擴增的研究文章，提供了一種快速高效的數(shù)字DNA擴增解決方案。相關研究內(nèi)容以“An integrated and multi-functional droplet-based microfluidic platform for digital DNA amplification”為題發(fā)表在國際權威雜志Biosensors and Bioelectronic上。

高集成多功能微流控芯片的設計

首先，為了實現(xiàn)一個高度集成和多功能的微流控平臺，研究團隊設計了一種特殊的芯片結(jié)構，如圖1所示。該芯片結(jié)構包括連續(xù)相（油）的進口、水相（樣品）的進口、用于生成液滴的流動聚焦結(jié)構、樹狀結(jié)構分割通道，以及用于原位擴增和檢測的收集室。這種設計不僅能實現(xiàn)高通量的液滴生成，還能保證反應過程的一體化。

特別需要注意的是，為了克服PDMS材料的多孔性以及透氣性帶來的挑戰(zhàn)，研究團隊采用了三明治的芯片結(jié)構制造方法。底部玻璃載板用于支撐芯片，PDMS芯片用于液滴的生成和擴增發(fā)生以及信號檢測，并添加了硅油進行預飽和，以防止液滴的蒸發(fā)。頂部的玻璃蓋片則能夠有效防止樣品在熱循環(huán)過程中的蒸發(fā)和損失。

此外，研究團隊巧妙地設計了魯爾接頭拼接，以提供方便的樣品裝載和壓力控制，并在接頭內(nèi)部設置油相儲備以提供密封保護。這種設計方法不僅有效地克服了PDMS材料多孔性導致的液滴蒸發(fā)挑戰(zhàn)，還確保了擴增信號的一體化檢測。同時，所采用的低成本制造方法也易于實施。

圖1 基于液滴的數(shù)字DNA擴增的全集成多功能平臺示意圖

微液滴生成及穩(wěn)定性優(yōu)化

液滴的大小、形狀和均一性對于高通量操作至關重要。為了提高液滴生成的通量和效率，研究團隊設計了一種樹狀結(jié)構分割通道，通過將大液滴等分為兩個較小的液滴，并通過分割角度和控制連續(xù)相和分散相的流速比，實現(xiàn)了對液滴尺寸的精確均一控制，使得該芯片設計在穩(wěn)定性和功能性方面表現(xiàn)出色，能夠?qū)崿F(xiàn)對液滴的精確控制，為后續(xù)實驗提供可靠的基礎。

為了保持液滴的穩(wěn)定性，在熱循環(huán)過程中，研究團隊采取了一系列優(yōu)化設計。首先，通過硅油預飽和PDMS，避免了油相在熱循環(huán)中的吸收。其次，通過對不同濃度的表面活性劑的測試優(yōu)化，實現(xiàn)了液滴在熱循環(huán)過程中的穩(wěn)定，并且對DNA擴增的性能影響較小。

綜上所述，通過改進和驗證，研究團隊實現(xiàn)了微流控系統(tǒng)中液滴生成和穩(wěn)定性的提升。在擴增熱循環(huán)后，超過90%的液滴保持了其原始形狀和狀態(tài)，表明該技術平臺在液滴的穩(wěn)定性方面具有良好效果。

圖2 微流控系統(tǒng)中液滴生成和穩(wěn)定性的優(yōu)化與驗證示意圖

目標分子檢測驗證

最后，研究團隊使用數(shù)字PCR（dPCR）和數(shù)字LAMP（dLAMP），針對兩種突變進行了檢測：EGFR外顯子20突變和HPV-16突變驗證了該技術平臺在DNA擴增中的可行性。EGFR外顯子20基因突變在非小細胞肺癌（NSCLC）患者中約占5% ~ 10％，而HPV感染是宮頸癌的主要原因，其中HPV-16是最常見的高危型，準確檢測對于指導治療以及改善預后至關重要。圖3結(jié)果顯示，通過數(shù)字PCR和數(shù)字LAMP，在擴增后，含有目標分子的液滴顯示出比其他液滴更高的熒光信號，表明目標分子的有效擴增。通過計算正熒光信號和負熒光信號的液滴數(shù)量，確定樣品的濃度。研究人員還使用了一定的閾值來排除擴增后由于液滴聚集而形成的大液滴。研究結(jié)果顯示，測量值與預期值之間呈現(xiàn)出線性、統(tǒng)計顯著的相關性。通過Poisson統(tǒng)計，測量值與預期值之間得到很好的匹配。

研究人員還將開發(fā)的平臺的結(jié)果與商業(yè)平臺的結(jié)果進行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在高度一致性，這表明該平臺作為數(shù)字DNA擴增的可行替代品具有準確性和可靠性。

圖3 集成化多功能的平臺在DNA擴增中的表現(xiàn)示意圖

綜上所述，在這項研究中，研究團隊成功開發(fā)出一款多功能的、易于操作的基于液滴的微流控平臺，用于進行數(shù)字DNA擴增，可用于數(shù)字PCR技術平臺。該技術將液滴制備、擴增及熒光信號檢測進行了集成，從而克服了現(xiàn)有方法的局限性。這一改進不僅簡化了工作流程，還在微制造方面降低了成本。該平臺易于制造和操作，適用于廣泛的用戶，進一步增加了其實用性。

此平臺實現(xiàn)了高通量的微液滴生成，能在5分鐘內(nèi)將40 μL樣品分配到超過50,000個均勻大小的微滴中（變異性< 2%）。包含目標分子的微液滴在擴增循環(huán)過程中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，并且能夠穩(wěn)定信號一段時間用于后續(xù)檢測。該平臺展示了處理多種目標和擴增方法的能力和可行性。

在對等溫和PCR的核酸定量方面，該平臺表現(xiàn)出了高靈敏度和準確性，顯示出巨大的潛力。該平臺有望通過幫助識別更多符合靶向治療條件的突變患者，并提供非侵入性監(jiān)測方法，對個體化醫(yī)學產(chǎn)生重大影響，并改善患者護理。此項工作具有創(chuàng)新性和重要意義，為未來的研究和臨床應用奠定了堅實基礎。







審核編輯：劉清