將小分子、核酸、蛋白質(zhì)和藥物導(dǎo)入細(xì)胞是監(jiān)測和了解細(xì)胞行為以及生物功能的重要途徑。然而，質(zhì)膜是阻止外源分子進(jìn)入細(xì)胞的生物屏障。因此，如何在保持細(xì)胞活力的同時高效地將外源分子遞送到細(xì)胞中是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一個重要課題。為了克服現(xiàn)有大規(guī)模細(xì)胞內(nèi)遞送方法的弱點，例如細(xì)胞活性和遞送效率不一致，主要基于膜破壞介導(dǎo)機制的微技術(shù)已成為一種有前景的解決方案。然而，利用化學(xué)質(zhì)膜穿孔進(jìn)行單細(xì)胞遞送的方法尚未得到廣泛研究。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近期，清華大學(xué)化學(xué)系林金明教授團(tuán)隊在ACS Applied Materials & Interfaces期刊上在線發(fā)表了題為“Chemical Plasma Membrane Perforation Generated by a Microfluidic Probe for Single-Cell Intracellular Protein Delivery”的論文。該研究使用微流控探針將含有毛地黃皂苷和目標(biāo)遞送物的溶液精確地作用到單細(xì)胞上。毛地黃皂苷與質(zhì)膜中的膽固醇結(jié)合誘導(dǎo)質(zhì)膜穿孔，目標(biāo)遞送物通過孔進(jìn)入細(xì)胞。碘化丙啶（0.67 kDa）和FITC-葡聚糖（10、40和150 kDa）可以在3分鐘內(nèi)成功引入單細(xì)胞，同時保持細(xì)胞活力。兩種蛋白質(zhì)（細(xì)胞色素C和親環(huán)素A）被遞送進(jìn)入細(xì)胞，并觀察到它們在細(xì)胞中的生理功能。

圖1 微流控探針誘導(dǎo)單細(xì)胞化學(xué)質(zhì)膜穿孔

隨后，研究人員利用Comsol Multiphysics軟件對微流控探針形成的微區(qū)域進(jìn)行數(shù)值模擬。使用熒光素（擴散系數(shù)=500 μm2/s）來指示溶質(zhì)擴散。結(jié)果表明，注入的溶液可以被完全吸出，并且溶質(zhì)被限制在液滴狀微區(qū)域內(nèi)而不會擴散，且微區(qū)域內(nèi)溶質(zhì)濃度分布均勻。研究人員計算了基質(zhì)上的剪切應(yīng)力，結(jié)果表明，基質(zhì)上的低剪切應(yīng)力不會對細(xì)胞造成額外的機械損傷。實驗在與模擬相同的條件下進(jìn)行，使用熒光素顯示微流控探針產(chǎn)生的微區(qū)域，其濃度分布與模擬結(jié)果一致。溶液的連續(xù)流動使微區(qū)域中毛地黃皂苷和目標(biāo)遞送物的濃度幾乎恒定，有利于維持遞送過程的連續(xù)性和穩(wěn)定性。

圖2 流體的數(shù)值模擬

接著，研究人員通過微流控探針進(jìn)行碘化丙啶（PI）的細(xì)胞內(nèi)遞送來驗證該方法的可行性以及優(yōu)化遞送條件。研究人員嘗試使用20 - 100 μg/mL毛地黃皂苷將PI遞送至U87細(xì)胞。隨著毛地黃皂苷濃度的增加，ts（PI開始進(jìn)入時間）和tm（PI進(jìn)入速度最大時間）逐漸減少，表明細(xì)胞穿孔加速。當(dāng)毛地黃皂苷濃度為60 μg/mL時，ts約為20 s，1 min內(nèi)即可觀察到清晰的熒光。此外，還嘗試了不同的PI濃度進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)遞送，較高的PI濃度也使得PI能夠更快地進(jìn)入細(xì)胞。還測試了流速對遞送結(jié)果的影響。注入流量保持2 μL/min，抽出流量在6~14 μL/min之間調(diào)整。當(dāng)抽吸流速大于8 μL/min時，進(jìn)入細(xì)胞的PI量隨著流速的增長而顯著增加。

圖3 毛地黃皂苷濃度、PI濃度和流速對細(xì)胞內(nèi)遞送的影響

為了證明該方法的效率和通用性，使用該方法將PI遞送至U87、HUVEC和A549細(xì)胞。當(dāng)遞送時間為20秒時，三種類型的細(xì)胞幾乎不發(fā)出熒光。隨著遞送時間逐漸增加，細(xì)胞的相對熒光強度顯著增加，遞送處理50 s后觀察到強烈的紅色熒光。由于洋地黃皂苷的作用，質(zhì)膜逐漸透化，PI通過質(zhì)膜上形成的孔繼續(xù)進(jìn)入細(xì)胞。接著，研究人員繼續(xù)研究了該方法遞送大分子的能力。使用不同分子量（10、40和150 kDa）的 FITC-葡聚糖作為目標(biāo)遞送物，結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC-葡聚糖可以在3 min內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞，并且FITC-葡聚糖進(jìn)入的量隨著遞送時間的增加而增加。

圖4 PI和FITC-葡聚糖遞送的結(jié)果

在驗證了這種方法用于單細(xì)胞胞內(nèi)遞送的可行性后，研究人員嘗試了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)遞送。細(xì)胞色素C（Cyt C）（Mw = 13 kDa）是線粒體中的一種蛋白質(zhì)，可將電子轉(zhuǎn)移到呼吸鏈以維持ATP的產(chǎn)生。當(dāng)Cyt C釋放到細(xì)胞質(zhì)中時，它會引發(fā)細(xì)胞凋亡。由于外源Cyt C在正常情況下不能進(jìn)入細(xì)胞，利用微流控探針將Cyt C遞送至A549中作為抗腫瘤藥物以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對照組和僅用毛地黃皂苷或Cyt C處理的細(xì)胞之間未觀察到caspase-3水平和Hoechst 33342染色結(jié)果的顯著差異。毛地黃皂苷誘導(dǎo)的質(zhì)膜穿孔不會引起細(xì)胞凋亡。僅用Cyt C處理的細(xì)胞中caspase-3的水平也沒有增加，表明正常情況下Cyt C不能穿過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞激活凋亡途徑。然而，在進(jìn)行毛地黃皂苷介導(dǎo)的Cyt C遞送的細(xì)胞中，caspase-3水平顯著增加，藍(lán)色熒光顯著增強。細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞體積縮小，并形成凋亡小體。這些結(jié)果表明，遞送的Cyt C成功誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且外源蛋白可以通過微流控探針有效地引入細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮作用。

圖5 Cyt C被遞送至A549以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步探索這種方法在細(xì)胞研究中的潛力，研究人員利用它來研究腫瘤耐藥性。CypA（Mw = 18 kDa）是一種廣泛存在的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，可充當(dāng)抗氧化劑。最近有報道稱CypA通過重塑細(xì)胞氧化狀態(tài)可以介導(dǎo)結(jié)直腸癌耐藥。BCNU是一種常用的抗腫瘤藥物，其誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的機制之一是谷胱甘肽還原酶的抑制導(dǎo)致ROS的積累。利用微流控探針將CypA遞送到U87中，研究CypA對膠質(zhì)瘤耐藥性的影響。與對照組相比，未經(jīng)CypA遞送的細(xì)胞經(jīng)BCNU處理1小時后ROS水平顯著升高，并且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。對于遞送CypA的細(xì)胞，ROS含量顯著低于未遞送細(xì)胞，并且細(xì)胞保持正常形態(tài)。結(jié)果表明，遞送的CypA在細(xì)胞中具有抗氧化作用，這可能增強U87對BCNU的耐藥性。抑制CypA表達(dá)可能是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在方法。

圖6 CypA對膠質(zhì)瘤耐藥性的影響

綜上所述，研究人員開發(fā)了一種基于開放式微流控探針的方法，以方便高效地實現(xiàn)單細(xì)胞遞送。該方法通過使用化學(xué)試劑對單個細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)膜穿孔，將最大分子量為150 kDa的外源目標(biāo)遞送物遞送到細(xì)胞中。與載體介導(dǎo)或場輔助遞送方法相比，該方法不需要對目標(biāo)遞送物進(jìn)行額外處理，無需物理場輔助的溫和遞送條件也避免了對目標(biāo)遞送物和細(xì)胞的額外損傷。此外，研究人員展示了使用微流控探針進(jìn)行Cyt C和CypA的細(xì)胞內(nèi)遞送，證明了該方法能夠研究外源蛋白質(zhì)對細(xì)胞生命活動的影響。未來，各種目標(biāo)遞送物（肽、蛋白質(zhì)、mRNA、DNA、質(zhì)粒、細(xì)胞器等）可以通過這種方法導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能和命運。而且該方法不需要昂貴的設(shè)備，操作簡單，有望成為單細(xì)胞遞送的一種理想方法。 清華大學(xué)化學(xué)系林金明教授為該論文的通訊作者，清華大學(xué)化學(xué)系2022級博士生宋揚為本論文的第一作者。該研究受到國家重點研發(fā)計劃（No.2022YFC3400700）和國家自然科學(xué)基金（No.22034005）的支持。

論文鏈接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.4c03013

審核編輯：劉清