圖 1. 在流式細(xì)胞儀中，熒光標(biāo)記的細(xì)胞在流中單列通過(guò)，并受到幾種不同波長(zhǎng)的激光照射。產(chǎn)生的熒光在分離成不同的波長(zhǎng)帶后進(jìn)行檢測(cè)。

多波長(zhǎng)激光引擎將激光源與預(yù)對(duì)準(zhǔn)和穩(wěn)定的自由空間聚焦光學(xué)器件或集成光纖傳輸系統(tǒng)相結(jié)合，簡(jiǎn)化了熒光顯微鏡專(zhuān)家和流式細(xì)胞儀 OEM 的對(duì)準(zhǔn)和集成任務(wù)。

如今，生命科學(xué)領(lǐng)域成功應(yīng)用的大多數(shù)光子學(xué)技術(shù)都基于某種形式的熒光檢測(cè)。這些技術(shù)包括研究人員用于活細(xì)胞成像的共聚焦顯微鏡、為臨床血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀器提供動(dòng)力的流式細(xì)胞術(shù)、DNA 測(cè)序儀等。

這些應(yīng)用通常受益于使用多個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)。在熒光顯微鏡中，這允許用戶(hù)激發(fā)各種目標(biāo)，包括傳統(tǒng)染料、基因表達(dá)的熒光蛋白和初始細(xì)胞內(nèi)容物。在神經(jīng)科學(xué)中，光遺傳學(xué)技術(shù)使用一個(gè)波長(zhǎng)來(lái)模擬或沉默目標(biāo)神經(jīng)元，而第二個(gè)波長(zhǎng)通過(guò)熒光鈣指示劑映射互連神經(jīng)元中的反應(yīng)。該方法最大限度地減少了激活和成像通道之間的串?dāng)_。流式細(xì)胞術(shù)通常使用多個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行多參數(shù)計(jì)數(shù)和/或分類(lèi)。這意味著使用幾個(gè)波長(zhǎng)分離的熒光染料信號(hào)通過(guò)單個(gè)儀器分析細(xì)胞或其他生物顆粒。

這些不同的應(yīng)用都具有一個(gè)共同的需求，即以微米或更高的精度聚焦、塑造和定位多束激光。越來(lái)越多的“激光引擎”滿(mǎn)足了這一需求，它將光源與高度穩(wěn)定的自由空間聚焦光學(xué)器件或集成光纖傳輸系統(tǒng)相結(jié)合。對(duì)于 OEM 和最終用戶(hù)來(lái)說(shuō)，這可以降低成本、避免耗時(shí)的光學(xué)對(duì)準(zhǔn)程序、縮短開(kāi)發(fā)時(shí)間并提高儀器的穩(wěn)定性和可靠性。

多參數(shù)流式細(xì)胞儀激光引擎

激光引擎最初是為流式細(xì)胞儀開(kāi)發(fā)的，流式細(xì)胞儀是基礎(chǔ)研究中常用的儀器，用于進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)以及對(duì)畜牧業(yè)和養(yǎng)魚(yú)業(yè)的精子或胚胎進(jìn)行分類(lèi)。在流式細(xì)胞術(shù)中，熒光標(biāo)記的細(xì)胞或其他小目標(biāo)被迫以單行流的形式流過(guò)流動(dòng)池(見(jiàn)圖 1)。它們穿過(guò)幾束激光束的相互作用區(qū)，這些激光束被整形并聚焦成像梯子上的橫檔一樣排列的長(zhǎng)線。產(chǎn)生的熒光和散射被收集起來(lái)，并通過(guò)二向色濾光片和帶通濾光片分離成波長(zhǎng)帶，然后再進(jìn)行檢測(cè)。一些高性能研究?jī)x器可以有 100 多個(gè)獨(dú)立的探測(cè)器。

第一批激光引擎為流式細(xì)胞儀制造商提供了使用多種激光波長(zhǎng)的更好途徑。然而，這些最初的激光引擎只是由多個(gè)單獨(dú)的激光器組裝而成。這不可避免地造成了冗余，因?yàn)槊總€(gè)激光器都有自己的控制器、接口和機(jī)械外殼。此外，它們是在面包板上構(gòu)建的，因此用戶(hù)或儀器制造商必須提供并對(duì)齊可調(diào)節(jié)的光學(xué)元件和支架。

第二代激光引擎直接針對(duì) OEM 儀器制造商。它們的特點(diǎn)是小型化并使用多個(gè)激光核心。這意味著所有激光器都使用單個(gè)驅(qū)動(dòng)電路板、接口和電源，并且全部包含在一個(gè)緊湊的外殼內(nèi)。

這種類(lèi)型的激光引擎包括光束整形和組合，每個(gè)激光器的焦點(diǎn)和指向都通過(guò)簡(jiǎn)單的螺旋式調(diào)節(jié)裝置(每個(gè)自由度一個(gè))獨(dú)立控制。這些產(chǎn)品中的第一款提供了流式細(xì)胞儀中最常用的四種波長(zhǎng)的選擇：405 nm、488 nm 和 640 nm，還有可選的 561 nm(見(jiàn)圖 2)。

圖 2. 在第二代激光引擎中，暫時(shí)移除裝飾性的外殼(插圖)，以便對(duì)最多四種激光波長(zhǎng)進(jìn)行獨(dú)立的光學(xué)調(diào)節(jié)。

如今，研究?jī)x器制造商通常會(huì)整合兩個(gè)激光引擎，以便獲取從紫外線 (UV) 到 640 nm 的多達(dá)八種波長(zhǎng)。這樣，使用一臺(tái)儀器就可以對(duì)多達(dá)數(shù)十種不同的數(shù)據(jù)參數(shù)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

微型光學(xué)元件、更低的成本、卓越的穩(wěn)定性

流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，從研究到個(gè)性化醫(yī)療，再到追蹤 COVID-19 等疾病的傳播和進(jìn)展。市場(chǎng)需求也促使儀器制造商縮短開(kāi)發(fā)時(shí)間、減小臺(tái)式機(jī)型號(hào)的尺寸、降低成本并延長(zhǎng)維護(hù)間隔。

激光制造商正通過(guò)第三代激光引擎來(lái)支持這一趨勢(shì)。它們基于微型光學(xué)元件，實(shí)現(xiàn)了更小的整體封裝、卓越的穩(wěn)定性和更高的經(jīng)濟(jì)性。

要實(shí)現(xiàn)封裝尺寸的減小，需要兩個(gè)關(guān)鍵的設(shè)計(jì)創(chuàng)新。第一個(gè)就是從一開(kāi)始就使用直徑較小的光學(xué)元件。這是有道理的，因?yàn)閮?nèi)部激光束直徑小于 1 毫米。因此，沒(méi)有令人信服的理由使用過(guò)去常用的 0.5 英寸直徑透鏡(約 13 毫米)及其相關(guān)的笨重支架。

其次，新引擎不使用傳統(tǒng)的光學(xué)支架。這些傳統(tǒng)支架由多個(gè)獨(dú)立的金屬部件、撓曲件和螺釘組裝而成。因此，由于熱循環(huán)和環(huán)境振動(dòng)，它們?cè)陂L(zhǎng)期使用中不可避免地會(huì)出現(xiàn)偏移。

最新的激光引擎采用了一種最初為密封腔內(nèi)激光器使用而開(kāi)發(fā)的安裝技術(shù)。它被稱(chēng)為 PermaTrack，其光學(xué)元件支架被取消。相反，光學(xué)元件在制造過(guò)程中對(duì)齊并永久粘合到穩(wěn)定的基板上。由于沒(méi)有單獨(dú)的機(jī)械部件，它們?cè)谡Ｊ褂眠^(guò)程中不可能移動(dòng)。

這種安裝技術(shù)成功地消除了流式細(xì)胞儀現(xiàn)場(chǎng)維修的主要原因之一：激光重新校準(zhǔn)，這對(duì)儀器制造商和用戶(hù)都有好處。此外，由于這項(xiàng)最新的激光引擎技術(shù)基于生產(chǎn)過(guò)程中的自動(dòng)化(即機(jī)器人)組裝和校準(zhǔn)，因此它提供了更好的單元間一致性。

無(wú)需打開(kāi)激光引擎進(jìn)行重新校準(zhǔn)，這帶來(lái)了另一個(gè)重大好處。它允許外殼密封，這樣內(nèi)部組件就不會(huì)暴露在灰塵或可能從有機(jī)材料中釋放出的化學(xué)物質(zhì)中。此外，還包括主動(dòng)“吸氣劑”，以進(jìn)一步保護(hù)原始環(huán)境。這種方法是為工業(yè)應(yīng)用提供長(zhǎng)壽命密封可見(jiàn)光和紫外激光器的同一種方法的改編。

實(shí)際上，工廠校準(zhǔn)和密封的激光引擎配置了四條(或三條)光束，通常采用交錯(cuò)聚焦線排列。盡管 OEM 可以指定不同的幾何形狀，但整個(gè)行業(yè)中這些線的相對(duì)分離已經(jīng)變得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化。使用可調(diào)聚焦光學(xué)元件可以在三維空間中調(diào)整光束階梯的位置，以適應(yīng)儀器組裝中各個(gè)單元之間的差異。

為顯微鏡用戶(hù)提供即插即用系統(tǒng)

同樣的理念也應(yīng)用于熒光顯微鏡，這種技術(shù)幾乎見(jiàn)于每個(gè)生命科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室——從大學(xué)到制藥廠。將多種激光波長(zhǎng)引入這些顯微鏡的集成解決方案已經(jīng)問(wèn)世一段時(shí)間了。

最常見(jiàn)的做法是通過(guò)光纖耦合來(lái)實(shí)現(xiàn)。這樣可以避免光學(xué)器件和相關(guān)硬件使顯微鏡直接空間變得雜亂。但這也意味著必須將多個(gè)激光器對(duì)準(zhǔn)光纖，然后將它們?nèi)狂詈系斤@微鏡的單個(gè)輸入光纖中。

對(duì)于熒光顯微鏡，通常首選單模光纖，因?yàn)檫@樣可以提高效率并實(shí)現(xiàn)清晰聚焦(更高分辨率)的樣品激發(fā)。但典型的單模光纖的纖芯直徑在 8.0–10.5 μm 范圍內(nèi)。使用具有五六個(gè)自由度的傳統(tǒng)光纖耦合支架將激光束對(duì)準(zhǔn)這種尺寸的光纖纖芯非常耗時(shí)。即使是經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員也可能需要幾個(gè)小時(shí)才能完成每臺(tái)激光器的這項(xiàng)任務(wù)。

一旦實(shí)現(xiàn)了對(duì)準(zhǔn)，在使用過(guò)程中以及長(zhǎng)期內(nèi)，仍存在著維持必要的微米級(jí)對(duì)準(zhǔn)度的問(wèn)題。操作儀器和環(huán)境溫度的正常變化很容易使其失去對(duì)準(zhǔn)度。此外，使用二向色濾光片、偏振器和波片來(lái)組合波長(zhǎng)也是一個(gè)挑戰(zhàn)。

激光制造商已經(jīng)通過(guò)類(lèi)似于光學(xué)總線的緊湊型模塊解決了這個(gè)問(wèn)題。這些模塊將多個(gè)光纖耦合激光源的輸出組合成一根單模光纖，為顯微鏡供電。用戶(hù)通過(guò)八個(gè)特定波長(zhǎng)的光纖端口提供輸入，這些端口使用卡入式連接器。輸出是一條光纖，在整個(gè) 405-640 nm 范圍內(nèi)具有恒定的數(shù)值孔徑 (NA)，無(wú)需用戶(hù)進(jìn)行任何調(diào)整。

如今，緊湊而智能的固態(tài)激光器幾乎像燈泡一樣易于操作。這使得生命科學(xué)研究人員和儀器制造商能夠?qū)Ｗ⒂谒麄兊墓ぷ?，而不是激光調(diào)整。這反過(guò)來(lái)又導(dǎo)致了熒光方法在實(shí)驗(yàn)室和臨床環(huán)境中的普及。激光引擎的不斷發(fā)展提供了同樣輕松訪問(wèn)多種波長(zhǎng)的能力，這將繼續(xù)為熒光技術(shù)帶來(lái)光明的未來(lái)。

審核編輯 黃宇