納米酶傳感器陣列是一種利用納米酶的酶促活性同時(shí)區(qū)分多種物質(zhì)的方法。與大型儀器不同，陣列檢測(cè)通常能夠在單次分析中區(qū)分多種目標(biāo)物。納米酶通常由金屬中心和配體組成，并且常常表現(xiàn)出多種類(lèi)酶活性，這使其能夠?qū)Χ喾N底物產(chǎn)生響應(yīng)，并實(shí)現(xiàn)對(duì)多種底物的同時(shí)檢測(cè)。然而，多種類(lèi)酶活性的存在可能會(huì)導(dǎo)致干擾，進(jìn)而降低檢測(cè)過(guò)程的準(zhǔn)確性。例如，過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶都對(duì)底物H?O?有響應(yīng)，氧化酶和過(guò)氧化物酶都對(duì)底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）有響應(yīng)。因此，在檢測(cè)目標(biāo)物時(shí)，無(wú)法確定是哪種類(lèi)酶活性導(dǎo)致了觀察到的結(jié)果。所以，制備一種具有多種類(lèi)酶活性、且能根據(jù)檢測(cè)需要對(duì)單一底物產(chǎn)生特定響應(yīng)的檢測(cè)方法是一種有效的解決方案。

為了減少多種類(lèi)酶活性帶來(lái)的干擾，研究人員通常會(huì)改變外部環(huán)境或合成功能性納米酶。例如，Guopeng Xu通過(guò)激光能量控制反應(yīng)的能壘來(lái)激發(fā)不同的類(lèi)酶活性。Guojian Wu合成了由多功能可視化分子印跡驅(qū)動(dòng)的可切換活性納米酶。Chu Wang通過(guò)用不同的手性配體修飾納米酶實(shí)現(xiàn)了選擇性檢測(cè)。然而，由于檢測(cè)時(shí)間和場(chǎng)地的限制，這種復(fù)雜的調(diào)控在食品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中可能并不適用。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠展現(xiàn)多種類(lèi)酶活性且能快速切換底物的納米酶，對(duì)于食品分析至關(guān)重要。

茶多酚含有大量的酚羥基，這些酚羥基具有抗氧化和清除自由基的特性，因此與氧化還原反應(yīng)密切相關(guān)。同時(shí)，茶多酚是茶葉中的重要活性成分，也是區(qū)分茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。納米酶的底物通常與氧化還原反應(yīng)有關(guān)。因此，將茶多酚作為基于可切換底物納米酶?jìng)鞲衅麝嚵械臋z測(cè)目標(biāo)具有重要的研究?jī)r(jià)值。通過(guò)改變條件，茶多酚和不同的氧化還原底物可以獨(dú)立發(fā)揮作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)茶多酚的精確區(qū)分，并進(jìn)而評(píng)估茶葉品質(zhì)。

設(shè)計(jì)原理

在這項(xiàng)工作中，我們利用ZIF-8模板合成了一種具有多種類(lèi)酶活性的三金屬納米酶（CuMnZn）。該納米酶被設(shè)計(jì)為在特定條件下對(duì)單一底物產(chǎn)生最佳響應(yīng)，從而避免了多種類(lèi)酶活性之間的相互干擾問(wèn)題。如方案1所示，通過(guò)調(diào)節(jié)pH值，可分別在酸性、近中性和堿性條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)三種底物的單一響應(yīng)。在每個(gè)相應(yīng)的pH條件下，該納米酶能對(duì)各自的底物產(chǎn)生最佳響應(yīng)，同時(shí)抑制對(duì)其他底物的響應(yīng)。最后，基于茶多酚能對(duì)這三種底物產(chǎn)生響應(yīng)的特性，我們將其應(yīng)用于茶多酚的區(qū)分和檢測(cè)。在機(jī)器學(xué)習(xí)的輔助下，我們能夠在室溫下短時(shí)間內(nèi)（5分鐘）100%準(zhǔn)確區(qū)分二級(jí)和非一級(jí)產(chǎn)地的綠茶，具有良好的應(yīng)用前景。

方案1.機(jī)器學(xué)習(xí)輔助的用于茶葉品類(lèi)識(shí)別的可切換納米酶反應(yīng)陣列示意圖。

數(shù)據(jù)介紹

圖1.三金屬納米酶的表征。(A)三金屬納米酶的制備過(guò)程。(B)三金屬納米酶的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。(C)三金屬納米酶的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）。(D)三金屬納米酶的X射線光電子能譜全譜，以及(E)三金屬納米酶的Mn 2p光譜。(F)三金屬納米酶的元素含量比例。

圖2.納米酶類(lèi)酶活性研究。(A)類(lèi)氧化酶活性。(B)類(lèi)多酚氧化酶活性。(C)類(lèi)過(guò)氧化氫酶活性。(D)類(lèi)過(guò)氧化物酶活性。(E)類(lèi)葡萄糖氧化酶活性。(F)反應(yīng)進(jìn)程與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系。

研究觀察到，三金屬納米酶對(duì)TMB（3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺）和酚類(lèi)物質(zhì)具有良好的氧化能力，并且能夠催化分解過(guò)氧化氫（H2O2），同時(shí)受到其他類(lèi)酶活性的干擾極小。如圖2A所示，納米酶氧化TMB的能力通過(guò)TMB從無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色得以證明。如圖2B所示，納米酶氧化酚類(lèi)的能力表現(xiàn)為無(wú)色的2,4 -二氯苯酚（2,4-DP）與4 -氨基吡啶（4-AP）結(jié)合后變?yōu)樽仙Ｈ鐖D2C所示，納米酶的類(lèi)過(guò)氧化氫酶活性可通過(guò)其分解H2O2的能力得以證實(shí)，這使得在TMB和天然辣根過(guò)氧化物酶存在的情況下，反應(yīng)體系不會(huì)顯色。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在H2O2存在的情況下，納米酶對(duì)TMB氧化能力的增強(qiáng)作用極小，這表明其類(lèi)氧化酶活性?xún)?yōu)于類(lèi)過(guò)氧化物酶活性（圖2D）。茶葉中含有一定量的葡萄糖，為探究葡萄糖是否會(huì)干擾茶多酚的檢測(cè)，研究對(duì)納米酶氧化底物葡萄糖的情況進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米酶幾乎無(wú)法氧化葡萄糖生成H2O2，而H2O2會(huì)使TMB變藍(lán)（圖2E）。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明，與傳統(tǒng)納米酶相比（表S1和S2），三金屬納米酶表現(xiàn)出較高的最大反應(yīng)速率（Vmax）和較低的米氏常數(shù)（Km）（圖S1）。結(jié)果顯示，所有三種底物（TMB、酚類(lèi)和H2O2）在5分鐘時(shí)反應(yīng)達(dá)到最大值（圖2F）。這表明該納米酶對(duì)底物具有強(qiáng)烈的響應(yīng)。

圖3. (A)不同pH值對(duì)不同反應(yīng)底物的影響。(B)制備比例對(duì)納米酶活性的影響。(C)不同pH值下TMB底物的動(dòng)力學(xué)表征。(D)三種納米酶底物反應(yīng)的實(shí)際圖像。(E)不同pH值下2,4 -二酚（2,4-DP）底物的動(dòng)力學(xué)表征。(F)不同pH值下H2O2底物的動(dòng)力學(xué)表征。

為了在不同pH條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)不同底物的特異性響應(yīng)，研究人員探究了納米酶在不同pH值下的活性。觀察發(fā)現(xiàn)，三種底物（TMB、苯酚和H2O2）的響應(yīng)明顯依賴(lài)于pH值的變化。納米酶對(duì)TMB的氧化作用主要集中在酸性條件下，在pH值為4時(shí)氧化能力最強(qiáng)，在接近中性時(shí)氧化作用消失。納米酶對(duì)苯酚的氧化在中性條件下最為顯著，在酸性和堿性條件下則明顯減弱。相比之下，類(lèi)過(guò)氧化氫酶活性?xún)H在堿性條件下才能觀察到（圖3A）。利用圖像的可視化表示有助于闡明底物反應(yīng)的趨勢(shì)（圖3D）。值得注意的是，在每個(gè)pH轉(zhuǎn)換條件下，相應(yīng)底物的響應(yīng)最佳，而另外兩種底物的響應(yīng)極小，從而確保了多種類(lèi)酶活性檢測(cè)的準(zhǔn)確性。隨后，對(duì)三金屬的制備比例進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)比例為1:6時(shí)，納米酶具有最佳的類(lèi)酶活性和底物切換響應(yīng)（圖3B）。研究人員還探究了模板對(duì)納米酶的作用。模板可以提高三金屬納米酶的分散性（圖S2），當(dāng)模板濃度（鋅濃度）在0.02 - 0.1M時(shí)，類(lèi)酶活性更強(qiáng)（圖S3）。但只有在模板濃度為0.1M時(shí)，納米酶才能實(shí)現(xiàn)底物切換的功能（圖3D）。此外，該納米酶還表現(xiàn)出出色的穩(wěn)定性（圖S4）和對(duì)常見(jiàn)離子的耐受性（圖S5）。通過(guò)動(dòng)力學(xué)分析研究了pH值對(duì)底物響應(yīng)的變化情況。如圖3C所示，在酸性條件（pH為4）下，納米酶對(duì)底物TMB表現(xiàn)出優(yōu)異的動(dòng)力學(xué)性能，然而，在中性和堿性條件下改變TMB濃度時(shí)，TMB的氧化速率變化極小，導(dǎo)致動(dòng)力學(xué)性能欠佳。同樣地，納米酶僅在pH為6.5（圖3E）和8.5（圖3F）時(shí)，對(duì)苯酚和H2O2表現(xiàn)出最佳動(dòng)力學(xué)性能，在其他pH值下動(dòng)力學(xué)性能會(huì)有所下降。

圖4. (A)不同類(lèi)型茶多酚對(duì)TMB顯色抑制作用的影響。(B)不同類(lèi)型茶多酚與納米酶類(lèi)多酚氧化酶活性的反應(yīng)情況。(C)不同類(lèi)型茶多酚對(duì)類(lèi)過(guò)氧化氫酶活性的影響。(D)單一茶多酚組分的指紋圖譜。(E)兩種茶多酚混合物組分的指紋圖譜。(F)三種茶多酚混合物組分的指紋圖譜。(G)濃度為100、50、20和2 μM的茶多酚的線性判別分析（LDA）圖。(H)濃度為100、50、20和2 μM的茶多酚的層次聚類(lèi)分析（HCA）圖。

不同的茶多酚因其酚羥基數(shù)量不同，具有不同的抗氧化能力。在此，我們以不同的茶多酚為底物，研究納米酶與茶多酚之間的關(guān)系。此外，它們能與所有三種底物發(fā)生相互作用，這使得它們成為該檢測(cè)方法的理想檢測(cè)目標(biāo)。如圖4A、4B和4C所示，八種茶多酚對(duì)TMB顯色的抑制作用各不相同，與4-AP結(jié)合后的顯色情況也明顯不同，并且對(duì)H2O2分解的抑制作用也有所差異?；谶@些觀察結(jié)果，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種三通道納米酶陣列檢測(cè)方法，用于檢測(cè)和區(qū)分不同種類(lèi)的茶多酚。這三個(gè)通道在三種pH值條件下分別只對(duì)各自的底物產(chǎn)生響應(yīng)，避免了干擾，確保了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

納米酶反應(yīng)在652nm、500nm和450nm處的吸光度值被用作區(qū)分八種茶多酚的依據(jù)。通過(guò)繪制不同茶多酚對(duì)三個(gè)通道響應(yīng)的指紋圖譜，我們能夠深入了解它們之間的相互作用（圖4D）。沒(méi)食子酸（GA）和表沒(méi)食子兒茶素（EGC）對(duì)TMB抑制和H2O2自由基清除通道的影響較大，這可歸因于它們的鄰三酚結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予了它們顯著的抗氧化和自由基清除能力 。在酚類(lèi)顯色通道中，表兒茶素（EC）和兒茶素（CC）由于其鄰二酚結(jié)構(gòu)易被氧化，因此會(huì)引發(fā)更明顯的響應(yīng) 。

在這三個(gè)通道中，茶多酚表現(xiàn)出不同的特征，而茶葉中的其他干擾物質(zhì)沒(méi)有響應(yīng)，這表明以這種方式構(gòu)建陣列來(lái)區(qū)分茶多酚是可行的。對(duì)濃度為100μM的數(shù)據(jù)集（3個(gè)傳感器通道×8種茶多酚×6個(gè)平行樣本）進(jìn)行進(jìn)一步的線性判別分析（LDA）表明，這八種茶多酚能夠被有效區(qū)分，且相互之間沒(méi)有重疊（圖4G）。隨后進(jìn)行的無(wú)監(jiān)督層次聚類(lèi)分析（HCA）算法（圖4H）顯示，每種茶多酚也都能很好地聚為一類(lèi)，這表明該陣列能夠高精度地區(qū)分茶多酚。為了進(jìn)一步驗(yàn)證傳感器的性能，對(duì)低濃度（50、20、10、5和2μM）的樣本也進(jìn)行了區(qū)分，結(jié)果很成功（圖4G、圖S6A和圖S6C）。在HCA算法下，所有樣本也都能很好地分離并正確分類(lèi)（圖4H、圖S6B和圖S6D）。這使得傳感器陣列能夠區(qū)分濃度在2μM至100μM之間的任何茶多酚種類(lèi)。此外，該傳感器具有強(qiáng)大的抗干擾能力，能夠100%準(zhǔn)確地識(shí)別和區(qū)分多種常見(jiàn)的干擾物質(zhì)（圖S7）?？紤]到茶多酚成分的內(nèi)部變異性，制備了一系列隨機(jī)混合的茶多酚，以模擬天然樣品中的復(fù)雜性。我們進(jìn)一步使用二元和三元混合茶多酚樣品（圖4E和4F）驗(yàn)證了傳感器的性能，發(fā)現(xiàn)這些樣品能夠100%被區(qū)分開(kāi)（圖S8A和S8C），并且通過(guò)層次聚類(lèi)分析（HCA）算法能夠正確分類(lèi)（圖S8B和S8D）。這表明，這種可切換底物的比色陣列在區(qū)分茶多酚方面具有出色的能力。

圖5. (A)判別分析模型流程圖。(B)幾種算法正確率的比較。(C)隨機(jī)種子與正確率之間的關(guān)系。(D)隨機(jī)劃分的訓(xùn)練集和測(cè)試集的熱圖。(E)隨機(jī)森林處理后訓(xùn)練數(shù)據(jù)的混淆矩陣，以及(F)測(cè)試數(shù)據(jù)的混淆矩陣 。

鑒于真實(shí)茶葉樣品中各種茶多酚的濃度各不相同，研究如何在忽略這些濃度差異的情況下區(qū)分茶多酚是一項(xiàng)有價(jià)值的工作。通過(guò)比較多種算法的準(zhǔn)確性，隨機(jī)森林模型被確定為區(qū)分效果最佳的模型，它能夠?qū)崿F(xiàn)100%的區(qū)分度（圖5B）。隨機(jī)森林算法是一種基于集成學(xué)習(xí)的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，它通過(guò)結(jié)合多個(gè)決策樹(shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果來(lái)提高模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)健性。多個(gè)決策樹(shù)的構(gòu)建增強(qiáng)了傳感器陣列的泛化能力。進(jìn)一步的研究表明，隨機(jī)種子的選擇會(huì)影響區(qū)分的準(zhǔn)確性。因此，本研究選擇4作為隨機(jī)數(shù)（圖5C）。將同一種茶多酚的所有濃度樣本歸為一組，最終得到了包含八個(gè)標(biāo)簽的數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集按照8:2的比例被劃分為訓(xùn)練集和測(cè)試集，目的是在忽略濃度影響的情況下進(jìn)行區(qū)分（圖5A）。一般的流程是使用劃分好的訓(xùn)練集構(gòu)建模型，然后將其應(yīng)用到測(cè)試集中，以評(píng)估模型準(zhǔn)確區(qū)分的能力。該模型能夠從輸入的訓(xùn)練集中自動(dòng)學(xué)習(xí)，并100%準(zhǔn)確地區(qū)分所有樣本。數(shù)據(jù)在模型的對(duì)角線上聚集，這表明模型的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值是一致的（圖5E）。測(cè)試集中100%的區(qū)分度也證實(shí)了這一點(diǎn)，這證明了模型構(gòu)建的準(zhǔn)確性（圖5F）。色差圖更直觀地展示了不同類(lèi)型茶多酚在不同濃度之間的差異（圖5D）?？傊S機(jī)森林模型在不考慮濃度的情況下區(qū)分樣本時(shí)，準(zhǔn)確性有了顯著提高，這有利于區(qū)分更復(fù)雜的樣本模型。

圖6. (A)八種茶多酚的線性回歸分析。(B)茶葉品種的隨機(jī)森林判別結(jié)果。(C)摻假茶葉品種的實(shí)物圖。(D)摻假茶葉品種的隨機(jī)森林判別結(jié)果。

通過(guò)成功忽略茶多酚的濃度差異，我們?cè)俅螌?shí)現(xiàn)了對(duì)多種茶多酚的回歸定量預(yù)測(cè)，這使得該傳感器陣列在實(shí)際樣品檢測(cè)中展現(xiàn)出卓越的區(qū)分能力。首先，利用最小二乘線性回歸模型對(duì)八種茶多酚進(jìn)行了定量分析，這有助于更詳細(xì)地分析茶葉樣品。每種茶多酚的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的線性關(guān)系具有高度相關(guān)性（R2值超過(guò)0.93），并且測(cè)試集的數(shù)據(jù)與預(yù)測(cè)模型高度吻合（圖6A）。為了評(píng)估傳感器陣列在實(shí)際環(huán)境中的適用性，我們選取了多種不同產(chǎn)地和質(zhì)量等級(jí)的市售綠茶進(jìn)行分析。每種茶葉取0.5克，加入20毫升純凈水，將溶液加熱至80℃并保持20分鐘。沖泡后的茶湯用0.5毫米孔徑的注射器過(guò)濾，然后稀釋10倍。如圖6B所示，這些樣品能夠被有效區(qū)分，即使存在幾種常見(jiàn)物質(zhì)，傳感器陣列仍能實(shí)現(xiàn)100%的區(qū)分度。這表明該傳感器陣列在實(shí)際應(yīng)用中不僅具有出色的區(qū)分能力，還具備一定程度的抗干擾能力（圖S9）。

最后，我們將非一級(jí)產(chǎn)地的普通茶葉混入一級(jí)產(chǎn)地的特種茶葉中（分別標(biāo)記為AD1至AD6），模擬市場(chǎng)上常見(jiàn)的摻假樣品。如圖6C所示，紅色方框表示人工摻假的不合格茶葉。僅通過(guò)外觀特征很難辨別摻假樣品，尤其是在沒(méi)有專(zhuān)業(yè)儀器的情況下。然而，通過(guò)傳感器陣列結(jié)合隨機(jī)森林模型進(jìn)行分析，可以直觀地呈現(xiàn)區(qū)分結(jié)果，并高精度地識(shí)別出摻假樣品（圖6D）。這表明，基于具有可切換底物的三通道傳感器陣列，并借助機(jī)器學(xué)習(xí)，該方法可用于復(fù)雜樣品的分析，同時(shí)能夠區(qū)分茶葉的產(chǎn)地和等級(jí)，具有廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。

總結(jié)

總之，我們合成了一種具有多種類(lèi)酶活性的三金屬納米酶，它在不同pH值下對(duì)單一底物表現(xiàn)出最佳響應(yīng)，而對(duì)其他底物無(wú)響應(yīng)。我們開(kāi)發(fā)了一種精確的三通道比色傳感器陣列，包含三種可切換的底物，即3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、酚類(lèi)物質(zhì)和H?O?，該陣列具有抗干擾性。基于不同的抗氧化、氧化顯色和抑制自由基的能力，該傳感器陣列成功地對(duì)八種茶多酚進(jìn)行了區(qū)分。同時(shí)，機(jī)器學(xué)習(xí)有助于區(qū)分與濃度無(wú)關(guān)的數(shù)據(jù)，這有利于復(fù)雜樣品的識(shí)別并展現(xiàn)出抗干擾能力。此外，該陣列在實(shí)際樣品中具有100%的識(shí)別能力，能夠區(qū)分摻假來(lái)源和等級(jí)的茶葉樣品。納米酶不僅具有多種類(lèi)酶活性，還具備切換底物響應(yīng)的能力，這有助于實(shí)現(xiàn)無(wú)干擾檢測(cè)。這些研究結(jié)果對(duì)功能性納米酶的制備及其在傳感器陣列中的合理應(yīng)用具有重要意義。

來(lái)源：微納傳感

https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.162447