圖1：動態(tài)活細胞與靜態(tài)固定細胞。答：活細胞具有社會性，通常彼此靠近生長，交換化學信息，并不斷在動態(tài)系統(tǒng)中移動。B. 固定單元是靜態(tài)的時間快照。首先，細胞被洗滌，然后用固定劑(黃色，如甲醛)處理，接著用對比劑(抗體、染料、鈣指示劑等，紅綠方塊表示)孵育，這些標記物可以包圍或進入細胞(因為在此過程中細胞膜被破開)。細胞隨后被夾在玻璃之間并密封，以避免固定劑蒸發(fā)。

介紹

大量生命科學研究涉及各種細胞/組織的成像。成像細胞和組織時主要有兩種范式：固定細胞和活細胞。

活著 vs 固定

“固定”細胞是指被保存得盡可能接近“真實”狀態(tài)的細胞。細胞在此過程中死亡，但其形狀和內(nèi)容物大多保留用于成像，且在固定細胞上進行后續(xù)制備步驟比活細胞更容易。不幸的是，化學和物理固定過程(如在甲醛中保存)會不可逆地改變細胞的組成和外觀，但大致的模式、網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)和DNA可以較大地保持。細胞在固定過程中也可能被打開，這使得抗體和化學物質(zhì)能進入細胞，從而更容易成像。

我們今天看到的大量細胞圖像來自于玻璃培養(yǎng)后，經(jīng)過固定、準備/染色，最后夾在蓋片之間并密封的細胞，如圖1所示。這使得這些細胞可以在相同條件下被成像數(shù)月甚至數(shù)年，基本上將細胞凍結(jié)在時間中，從而實現(xiàn)詳細分析。然而，這些圖像并不能代表活體系統(tǒng)中的細胞行為和特征，而活體系統(tǒng)更具有生物學意義的數(shù)據(jù)。

圖1：動態(tài)活細胞與靜態(tài)固定細胞。答：活細胞具有社會性，通常彼此靠近生長，交換化學信息，并不斷在動態(tài)系統(tǒng)中移動。B. 固定單元是靜態(tài)的時間快照。首先，細胞被洗滌，然后用固定劑(黃色，如甲醛)處理，接著用對比劑(抗體、染料、鈣指示劑等，紅綠方塊表示)孵育，這些標記物可以包圍或進入細胞(因為在此過程中細胞膜被破開)。細胞隨后被夾在玻璃之間并密封，以避免固定劑蒸發(fā)。

活細胞成像顧名思義，細胞在活體時被成像，通常是在培養(yǎng)基中。與代表永不變化的靜態(tài)單元不同，活性單元代表了隨時間移動和變化的動態(tài)單元。這意味著影像隨時間變化(稱為“延時攝影”)對活細胞成像非常重要。然而，對細胞或組織等復(fù)雜三維物體進行長期成像，會產(chǎn)生四維影像和一系列新的問題。一個主要問題是對比劑和染色。

細胞及其內(nèi)部較小結(jié)構(gòu)大多是水，因此是透明的。在玻璃或透明塑料背景上拍攝這些水袋時，圖像信息不多，因此必須有某種對比劑或染料/染色劑，以顯示所有細胞成分。對于固定細胞，你可以直接添加染色劑，因為這些細胞已經(jīng)死去固定，不會受到影響。對于活細胞來說，存在毒性問題，染色活細胞通常會導致細胞死亡。

由于染色問題，大多數(shù)活細胞成像采用明場技術(shù)，僅用光照亮可觀察到的微弱光源。直到20世紀40年代相差顯微鏡的發(fā)明，活細胞成像才真正起飛，因為能夠在不使用對比劑/染色劑的情況下更好地觀察活細胞。

相差顯微鏡

當光通過高密度介質(zhì)(水、油、玻璃等)時，速度會減慢。離開高密度介質(zhì)后，光的相位略有偏移，相位相位略微偏移，而光線則沒有穿過任何密集物質(zhì)。這被稱為相位偏移。如果相位偏移的光與正常光相遇，它們幾乎會相互抵消(相消干涉)，導致相交點的光強度大幅降低。

相位對比顯微鏡利用相位偏移來改變光的強度。樣品被穿過光闌的光照射，形成光環(huán)。這個光環(huán)穿過樣品(比周圍空氣密度高)，并且發(fā)生相位偏移，光線根據(jù)樣品部分的厚度不同，向不同方向折射。大多數(shù)生物樣本厚度不均，會導致各種不同的折射。這種折射的相位移光穿過由內(nèi)外部分組成的相位環(huán)。如果折射光穿過環(huán)的外層，則會進一步相位偏移，呈現(xiàn)為暗光。 如果折射光穿過環(huán)的內(nèi)側(cè)，它看起來很亮。通過這種方式，細胞的不同部分根據(jù)厚度呈現(xiàn)明亮或暗淡，從而在圖像中獲得更好的對比度。這種相較于明場的改進可見于圖2。

相機技術(shù)、像素密度和靈敏度的進步推動了相位對比的進步以及定量相位對比的發(fā)展。使用定量相差技術(shù)拍攝的圖像可以自動處理，隨時間從動態(tài)單元中提取大量信息。只需一次曝光，圖像還可在不同焦平面拍攝，從而實現(xiàn)更好的三維成像，尤其是在旋轉(zhuǎn)掃描下，能夠隨時間拍攝活細胞的高分辨率三維圖像。這些進步使活細胞成像能夠得到更精確的分析。

圖2： 相位對比顯微鏡與明場顯微鏡。最上排是明場圖像，左側(cè)是顯微鏡孔徑。底排是相同樣品的相位對比圖像，左側(cè)配有暈顯微鏡孔徑。這些透明樣品在明場下難以成像，但在相差成像中，信息量增加則更加清晰。

活熒光顯微鏡

如果由于毒性問題無法用熒光染料染色活細胞，那么活細胞能否用熒光顯微鏡成像?相位對比無法像熒光顯微鏡那樣觀察特定蛋白質(zhì)和細胞組分，限制了可進行的實驗范圍。

解決方案是熒光蛋白(FPs)。其中最著名的是綠色熒光蛋白(GFP)，在另一篇題為《什么是GFP?》的短文中詳細介紹了它。多種不同顏色的FP使得現(xiàn)場熒光實驗的深度和定制性堪比固定細胞熒光成像。通過將GFP基因直接插入細胞基因組，遺傳編碼的FP允許在每次成像中將非侵入性的熒光標記附著在任何蛋白質(zhì)或細胞組分上，即使跨越多代，因為FP通常具有遺傳性。圖3中可以看到多FP的實時熒光成像。

雖然熒光活成像最初還不確定，但隨著熒光標記的引入，對帶有熒光標記的細胞進行詳細的延時成像變得可行且簡單，開拓了活細胞成像的領(lǐng)域。

圖3： 對海膽胚胎進行實時熒光延時成像，細胞核被青色熒光蛋白(CFP)染色，細胞核被黃色熒光蛋白(YFP)染色。每張圖片都顯示時間戳(以毫米：秒為單位)。這些細胞被描繪成分裂，細胞的遺傳物質(zhì)被拉成兩塊相同的部分，準備分裂。圖像采用激光掃描共焦點顯微鏡拍攝。

活細胞成像用相機

在選擇科學相機進行檢測時，所需因素會根據(jù)樣品需求而高度變化。如果樣品移動不快且需要長時間曝光以實現(xiàn)延時，CCD是不錯的選擇;但如果樣品運動速度快(如細胞器)、低光環(huán)境且曝光時間較短，研究人員通常使用背光式sCMOS相機。鑒于探測器種類繁多，確保相機的分辨率、靈敏度、速度和視野與應(yīng)用相匹配。

總結(jié)

總體而言，活細胞成像是固定細胞成像的有力替代方案，隨著定量相位對比和活熒光等技術(shù)的進步，越來越多的研究人員開始進行細胞實時成像，以獲得最具生物學意義的數(shù)據(jù)。

審核編輯 黃宇