在剛剛過去的蘇州標(biāo)記免疫分析專業(yè)委員會(huì)2019學(xué)術(shù)峰會(huì)上，浙江清華長三角研究院分析測(cè)試中心蔡強(qiáng)主任詳細(xì)講述了分子診斷IVD設(shè)備的發(fā)展史。

蔡強(qiáng)：研究員、浙江清華長三角研究院分析測(cè)試中心主任、國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心應(yīng)用技術(shù)合作中心副主任

分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷在臨床診斷中的技術(shù)主要包括PCR技術(shù)、芯片技術(shù)和測(cè)序技術(shù)。臨床檢測(cè)中，分子診斷越來越受到重視，但市場(chǎng)占比與生化診斷、免疫診斷相比，還存在一定的差距。

目前分子診斷在體外診斷中的主要的應(yīng)用領(lǐng)域，包括對(duì)病毒、細(xì)菌等微生物的篩查及定性定量檢測(cè)，藥物篩選及用藥分析以及基因早期的分析。在微生物檢驗(yàn)檢測(cè)方面，分子診斷相對(duì)于免疫診斷具有一定的優(yōu)勢(shì)；基因圖譜分析方面，雖然目前相關(guān)研究很多，但在該領(lǐng)域應(yīng)用的臨床價(jià)值還有待發(fā)掘。

分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷和微生物診斷存在一定的關(guān)聯(lián)性，微生物診斷是外部特性分析，而分子診斷則是對(duì)內(nèi)部分子的檢測(cè)。

表1 分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷主要技術(shù)發(fā)展的時(shí)間軸

早期的分子診斷設(shè)備，多為大型集成化設(shè)備，包含很多的操作模塊。在原理上，早期的設(shè)備并無很多創(chuàng)新，主要是將多種手工操作內(nèi)容自動(dòng)化和集成化，發(fā)展到基因芯片，才有了原理性的突破。1990年提出的人類基因組計(jì)劃、后來的蛋白組學(xué)以及從近期開始的微生物組計(jì)劃，極大的推動(dòng)了分子診斷設(shè)備的發(fā)展。產(chǎn)品方面，較早期時(shí)有Affymetrix公司推出的第一塊商業(yè)化基因芯片。

接下來是PCR儀器的發(fā)展。早期的PCR儀器，是簡單的DNA解鏈、復(fù)制、復(fù)性等過程，除了水浴鍋?zhàn)詣?dòng)化，并沒有太多技術(shù)含量。數(shù)字PCR技術(shù)出現(xiàn)后， 與生物信息學(xué)和微型加工技術(shù)關(guān)聯(lián)起來，發(fā)展速度很快。再后來出現(xiàn)了微流控技術(shù)和基因測(cè)序技術(shù)?；驕y(cè)序技術(shù)經(jīng)歷了一代、二代、三代，目前測(cè)序技術(shù)，仍然是重要的發(fā)展方向。

分子診斷主要技術(shù)發(fā)展的時(shí)間軸

前處理復(fù)雜導(dǎo)致分子診斷的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用成為瓶頸

分子診斷和免疫診斷、生化診斷設(shè)備不同的地方，很大程度在于樣品前處理。免疫檢測(cè)對(duì)象主要是一些游離的大分子，處理相對(duì)容易，但分子診斷樣本處在細(xì)胞當(dāng)中，處理過程容易被污染，因此前處理系統(tǒng)相對(duì)復(fù)雜。

分子診斷系統(tǒng)的組成包括樣本前處理系統(tǒng)、檢測(cè)處理系統(tǒng)和分析處理系統(tǒng)。樣本前處理系統(tǒng)依據(jù)其功能的豐富程度又包括移液操作和核酸提取兩個(gè)平臺(tái)，依據(jù)使用場(chǎng)所不同分為實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化平臺(tái)和現(xiàn)場(chǎng)前處理平臺(tái)。

目前前處理設(shè)備中，全自動(dòng)的移液工作站是比較成功的設(shè)備。它是一種全自動(dòng)、高精度移液系統(tǒng)，專門用于小體積的PCR、qPCR體系配置，能夠完全替代手工，保證了配置實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增體系的正確性、精密度及重復(fù)性。缺點(diǎn)是功能單一，臨床及科研應(yīng)用尚有一定局限性。

貝克曼自動(dòng)化工作站Biomek i7

核酸提取設(shè)備，主要是自動(dòng)核酸提取儀，該儀器集成了自動(dòng)移液工作站和標(biāo)準(zhǔn)耗材，在以其預(yù)設(shè)程序控制下進(jìn)行核算分離的儀器，這一類自動(dòng)化系統(tǒng)在科研和臨床中應(yīng)用最為廣泛。提取方法的核心是免疫磁珠，包括磁珠吸附和磁珠分離等。除磁珠提取純化方法外，還有其他純化方法，如柱層析法。

托摩根核酸提取儀 MM96

目前，現(xiàn)場(chǎng)分子診斷還存在諸多問題。免疫檢測(cè)中可用試紙條等材料，檢測(cè)方便，但是分子診斷沒有這類材料可用，主要原因是樣品前處理無法達(dá)到這種檢測(cè)目的。當(dāng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)，在很開放的環(huán)境下，如何提取純化DNA，目前仍沒有簡易方法。現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求，目前在醫(yī)院的臨檢中心還不大，對(duì)于基層的衛(wèi)生所，或許會(huì)存在這樣的需求，從這個(gè)問題也引發(fā)出醫(yī)療模式應(yīng)該往什么方向發(fā)展的思考。

分子診斷的三大檢測(cè)平臺(tái)

分子診斷主要的檢測(cè)平臺(tái)為PCR儀、芯片系統(tǒng)以及基因測(cè)序平臺(tái)。

PCR儀——數(shù)字PCR是未來發(fā)展趨勢(shì)

分子診斷設(shè)備另一個(gè)重要的組成內(nèi)容是PCR儀器。常規(guī)的PCR目前技術(shù)上可提升的空間很有限，但很多部件只有少數(shù)幾家廠家做的不錯(cuò)。

熒光定量PCR，國內(nèi)有很多廠家生產(chǎn)，技術(shù)、元器件等各方面正在迅速趕超國外儀器廠商水平，但這未必是國內(nèi)廠商最終的發(fā)展方向。得益于光源及檢測(cè)器件小型化趨勢(shì)，現(xiàn)在的熒光PCR儀越來越小型化。

數(shù)字PCR是PCR領(lǐng)域未來發(fā)展的趨勢(shì)，目前有一些廠商在研究生產(chǎn)，比如銳訊生物、新羿生物、領(lǐng)航基因等?，F(xiàn)在數(shù)字PCR的售價(jià)很高，主要原因是后端檢測(cè)器件靈敏度要求高，成像器件技術(shù)先進(jìn)，造成成本偏高。當(dāng)然，因?yàn)閿?shù)字PCR有絕對(duì)定量的功能，對(duì)于分子檢測(cè)意義重

微滴式數(shù)字PCR的檢測(cè)流程

表2 3種PCR的比較

DNA微陣列——基因芯片

熒光原位雜交（FISH），是一種傳統(tǒng)方法，對(duì)于原位切片的分析有一定的意義。儀器本身比較簡單，就是熒光顯微鏡，外加一個(gè)殼構(gòu)成的一個(gè)圖像分析儀。檢測(cè)過程是在一定的溫度下將切片加入設(shè)備中，成像。雜交的另一種方式是利用芯片進(jìn)行，主要是DNA微陣列芯片。芯片技術(shù)從上世紀(jì)90初期開始研究到現(xiàn)在，已經(jīng)有近三十年時(shí)間，目前已經(jīng)應(yīng)用到診斷當(dāng)中，用做疾病篩查。熒光原位雜交最核心的地方在于診斷試劑而非設(shè)備。目前的檢測(cè)方式主要采用熒光標(biāo)記的方式，在靈敏度方面，已經(jīng)能夠滿足檢測(cè)要求，因此化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記方式相對(duì)較少。

美谷分子GenePix 4300A&4400A微陣列基因芯片掃描儀

第四代基因測(cè)序成為資本追逐熱點(diǎn)

基因測(cè)序的發(fā)展，從最早獲得諾貝爾獎(jiǎng)的一代，到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到第四代。原理上，第一代測(cè)序儀可認(rèn)為是人工操作方法的儀器實(shí)現(xiàn)，相對(duì)比較簡單。現(xiàn)在的第三代測(cè)序和第四代測(cè)序的原理已有一定區(qū)別。目前，高通量測(cè)序的需求很大，發(fā)展很迅速，國內(nèi)在基因測(cè)序儀器的發(fā)展也將會(huì)越來越快。第三代和四代測(cè)序儀的價(jià)值在于直接讀取功能大，但成本很高，測(cè)序時(shí)間長。把測(cè)序降到10美元以下是全球相關(guān)企業(yè)追求的目標(biāo)，如果實(shí)現(xiàn)，測(cè)序在診斷中的應(yīng)用將會(huì)更多的取代其他技術(shù)。

四代測(cè)序，即納米孔技術(shù)測(cè)序，目前已經(jīng)成為資本市場(chǎng)追逐的熱點(diǎn)，容量約為幾十億美元。原理很簡單，就是DNA鏈打開后穿過一個(gè)很細(xì)的孔，單個(gè)堿基對(duì)通過納米尺寸的通道時(shí)，會(huì)引起通道點(diǎn)穴性能的變化。四代測(cè)序具有高讀長、易集成、小型化、高速度、大通量等優(yōu)勢(shì)。納米孔所通電流很小，為10-18-10-15A，遠(yuǎn)低于熒光檢測(cè)電流，所以目前檢測(cè)時(shí)間大約需要幾個(gè)小時(shí)到十幾個(gè)小時(shí)，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，后期有望將測(cè)序時(shí)間縮短到半小時(shí)。

納米孔主要包括兩大類生物納米孔和固態(tài)納米孔。生物大分子納米孔發(fā)展較早，已經(jīng)有了相應(yīng)的設(shè)備，體積很小，準(zhǔn)確率較低。固態(tài)納米孔，目前還是實(shí)驗(yàn)室水平，有少數(shù)四代測(cè)序公司已經(jīng)開始做固態(tài)納米孔測(cè)序儀。固態(tài)納米孔的檢測(cè)方式很多，在基底上做一些材料摻雜，具有半導(dǎo)體特性，可替代光學(xué)器件，精確度也等性能指標(biāo)更好。因?yàn)楣虘B(tài)納米孔使用的是標(biāo)準(zhǔn)的微電子工藝，如果可以規(guī)?；a(chǎn)，可以降低測(cè)序儀生產(chǎn)成本，值得推廣。

測(cè)序結(jié)束后，數(shù)據(jù)處理比其他診斷方法更為復(fù)雜。免疫檢測(cè)的IVD設(shè)備后期用到的主要是數(shù)據(jù)庫管理，無需數(shù)據(jù)處理，但是分子診斷數(shù)據(jù)需要用算法進(jìn)行處理，這些算法也就是生物信息學(xué)的發(fā)展源頭。目前來講，做算法的人才和做軟件的人才都并不缺乏，缺乏的是能夠?qū)⑺惴ㄗ龀绍浖娜瞬?，這是基本事實(shí)。目前很多高校已經(jīng)發(fā)表了很多算法相關(guān)的論文，但是軟件依舊很少。目前很多檢測(cè)機(jī)構(gòu)所用的數(shù)據(jù)分析軟件多是英文軟件，很多還是開源軟件，這種軟件不適合醫(yī)院檢驗(yàn)使用。因此，數(shù)據(jù)處理軟件不足，對(duì)測(cè)序設(shè)備在臨床的應(yīng)用是個(gè)非常棘手的問題。

除了上述測(cè)序技術(shù)，DNA條形碼與測(cè)序結(jié)合起來，未來在臨床上或可發(fā)揮一定的作用。DNA條形碼是利用標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增、較短的DNA片段在物種內(nèi)的的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識(shí)別系統(tǒng)。目前主要用于物種鑒定。