隨著全球傳染病的流行，核酸檢測技術如聚合酶鏈反應（PCR）和等溫擴增在各種疾病的快速診斷中發(fā)揮了重要作用。

通常情況下，樣品需要通過冷鏈運輸到配備良好的醫(yī)院或檢測中心進行檢測。傳統(tǒng)的檢測過程高度依賴專業(yè)技術人員進行人工操作，從樣品到結果的整個過程耗時較長，無法滿足快速現場檢測的需求，特別是在資源有限的地區(qū)。此外，樣品的運輸不僅增加了成本，在儲存和運輸條件不當的情況下還可能導致樣本失效，造成假陰性結果。因此，開發(fā)快速、簡單、低成本的現場檢測平臺具有重要意義。

近日，北京師范大學-香港浸會大學聯合國際學院（UIC）雷波教授團隊、暨南大學董鋮副教授與珠海市迪奇孚瑞生物科技有限公司合作開發(fā)了一種基于數字微流控（DMF）技術和環(huán)介導等溫擴增（LAMP）顯色反應的可視化檢測平臺。

該平臺包含多個反應單元，可同時檢測多個樣本中的多個靶標基因，大大提高了檢測效率。此外，利用DMF強大的液滴操控能力，實現了自動化終點檢測，避免了傳統(tǒng)終點檢測方法中由于開蓋等人工操作引起的污染問題。該研究通過將高濃度的干燥染料應用于LAMP的顯色檢測，大大提高了小體積反應液滴（5 μl）的顯色程度，使得反應結果無需特定的光源條件，在環(huán)境光照下即可進行肉眼判讀。

圖1 用DMF-LAMP方法進行對蝦疾病診斷：（a）樣品制備；（b）芯片上操作和LAMP反應；（c）DMF芯片的側視圖和控制系統(tǒng)的方塊圖；（d）中性紅的分子結構以及由陽性LAMP擴增引起的顏色轉變；（e）從樣品到結果的整個過程的時間軸

該平臺可以應用于水產病害檢測，快速、準確地檢測出對蝦的三種常見病原體：腸細胞隱孢子蟲（EHP）、傳染性皮下和造血組織壞死病毒（IHHNV）以及白斑綜合征病毒（WSSV），檢測限為101拷貝/μL DNA。在這項研究中，該團隊還對DMF-LAMP方法進行了特異性和真實樣品檢測能力的評估。特異性實驗結果表明，該方法在與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌以及早期死亡綜合征（EMS）和對蝦血細胞虹彩病毒（SHIV）等水及水產品中常見病原體的交叉反應測試中均無非特異性擴增，表現出良好的特異性。在真實樣本檢測實驗中，分別用DMF-LAMP法和qPCR商業(yè)試劑盒對58個蝦樣本進行檢測，結果表明，DMF-LAMP方法與商業(yè)化的qPCR方法檢測結果高度一致，Kappa值在0.91至1之間，證明了該方法在實際應用中的可靠性和準確性。

圖2 DMF 芯片設計與制造：ITO玻璃上涂有疏水表面作為頂板，覆有疏水涂層的PCB基板被用作底板。在芯片組裝之前，底板上裝載了LAMP試劑并進行了風干處理。這兩個板之間夾著一個0.6 mm的間隔層用于液滴傳輸和LAMP反應 該團隊還提出一種基于RGB的圖像處理方法，利用智能手機在不同室外光照下獲得結果圖像，并且通過RGB分析，提出了一種簡單的判讀方法，未來有望創(chuàng)建自定義的手機App，以實現大批量結果的快速自動化分析。

圖3 基于RGB的圖像處理分析：（a）在DMF芯片上進行包含中性紅的LAMP反應，并使用智能手機捕捉圖像。手動選擇感興趣區(qū)域（ROI），并在ImageJ中測量ROI的平均RGB值；（b）根據在實驗室LED照明下捕捉的圖像提取RGB值，比較陰性反應（n = 120）和陽性反應（n = 120）的平均值；（c）由陰性和陽性反應RGB值計算得出的差值；（d）在不同照明條件下，繪制陰性（N-）和陽性（P-）結果的R/G比和B/G比的圖表

該成果以“A digital microfluidic platform coupled with colorimetric loop-mediated isothermal amplification for on-site visual diagnosis of multiple diseases”為題，發(fā)表在英國皇家化學會期刊Lab on a Chip上。

總體而言，該研究建立的DMF-LAMP平臺在臨床、生物醫(yī)學、食品安全和環(huán)境等領域具有廣泛應用前景，具有成本低、操作簡單，檢測效率高等優(yōu)勢。未來將進一步在該平臺上整合樣本處理如核酸提取等步驟，以實現“樣本進-結果出”的一體化檢測。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1039/D2LC01156E