圖1：本文基于Feng et al., 2022, NIR-II Multifocal Structured Illumination Microscopy

光學(xué)顯微鏡是人類(lèi)研究各種生物學(xué)問(wèn)題不可或缺的強(qiáng)大手段。然而，生物組織的復(fù)雜組成和異質(zhì)性帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)——光線在傳播過(guò)程中會(huì)被生物質(zhì)散射，嚴(yán)重影響最終獲得的空間分辨率和穿透深度。

傳統(tǒng)熒光成像技術(shù)一般基于可見(jiàn)光(VIS:400–700 nm)和近紅外一區(qū)(NIR-I:700–1000 nm)這兩個(gè)窗口。近年來(lái)，受益于波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光子在生物組織內(nèi)傳播時(shí)散射率更低、近紅外二區(qū)(NIR-II:1000 1700nm)自體熒光背景更弱等優(yōu)點(diǎn)，基于NIR-II的熒光成像技術(shù)引起了科研人員的廣泛興趣。

在NIR-II區(qū)，科研人員可以獲得更深的生物組織穿深和更低的背景噪音;另一方面，基于InGaAs傳感器的高效短波紅外(SWIR)相機(jī)的不斷進(jìn)步也極大地促進(jìn)了NIR-II成像技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

受NIR-II成像優(yōu)點(diǎn)的啟發(fā)，科研人員又開(kāi)發(fā)了幾類(lèi)在NIR-Ⅱ區(qū)域發(fā)射的熒光探針以及技術(shù)，推動(dòng)了NIR-II成像技術(shù)的進(jìn)步。

創(chuàng)新方案

在這份工作中，科研及研發(fā)人員通過(guò)將多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(MSIM)集成到NIR-II熒光顯微技術(shù)中，首次實(shí)現(xiàn)了NIR-II MSIM。該系統(tǒng)在高散射介質(zhì)2.5mm深度處的空間分辨率達(dá)到近1.49μm。

多焦點(diǎn)照明模式是通過(guò)聚焦一束相位調(diào)制的高斯光束生成的，其波前由加載有計(jì)算機(jī)生成全息圖(CGH)的相位空間光調(diào)制器(SLM)整形。系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)示意圖請(qǐng)見(jiàn)圖2。

圖2：NIR-II MSIM系統(tǒng)及原理示意圖(a)NIR-II MSIM示意圖。BE：擴(kuò)束器;HWP：半波片;PBS：偏振光分離器;M1-2：反射鏡;RL1–4：中繼透鏡;RM：矩形遮罩;DM：分色鏡;OBJ，物鏡;MS：移動(dòng)臺(tái);LPF，長(zhǎng)通濾波器，TL，管透鏡。插圖顯示CGH 在SLM平面上的輪廓(左)和在OBJ焦平面的模擬多焦圖案(右)。(b)NIR-II染料的吸收和光致發(fā)光產(chǎn)生的發(fā)射。(c)12×12多焦照明模式實(shí)驗(yàn)結(jié)果。上邊界和右邊界對(duì)應(yīng)于沿兩個(gè)正交方向的最大強(qiáng)度投影(MIP)方向。這里，面板(a)和(c)中的ξ和η對(duì)應(yīng)目標(biāo)焦平面上的笛卡爾坐標(biāo)。(d)單個(gè)NIR-II染料顆粒的NIR-II WF圖像(上部插圖)和NIR-II MSIM圖像(下部插圖)的歸一化橫截面輪廓(點(diǎn))和高斯擬合(線)。

通過(guò)用波長(zhǎng)為850nm的激光激發(fā)明亮的NIR-II熒光團(tuán)，該系統(tǒng)可以在0–2.5mm的成像深度范圍內(nèi)以增強(qiáng)的空間分辨率和對(duì)比度完成圖像重建。見(jiàn)圖3以及圖4。

圖3：NIR-II MSIM系統(tǒng)增強(qiáng)分辨率示意圖。(a)、(b)分別為分散的NIR-II染料的NIR-II WF圖像和NIR-Ⅱ MSIM圖像。下圖為圖中方框部分的放大結(jié)果。(c)沿(a)和(b)下圖中所示彩色虛線的歸一化強(qiáng)度示意圖。(d)兩個(gè)插圖的徑向平均強(qiáng)度分布，為(a)、(b)上圖二維傅里葉變換的結(jié)果。

圖4：不同光譜窗口的NIR-II MSIM成像。圖像分別為通過(guò)截止波長(zhǎng)為(a)1000nm的濾光片;(b)1300nm的濾光片的結(jié)果。(c) –(e)(a)和(b)中所示虛線的歸一化強(qiáng)度分布。

在更長(zhǎng)的發(fā)射波長(zhǎng)下獲得的結(jié)果也顯示出優(yōu)越的性能。

該工作證明了NIR-II MSIM是一種強(qiáng)大的生物成像觀測(cè)方法，可以提供深度穿透能力以及增強(qiáng)的空間分辨率和對(duì)比度。在未來(lái)，將會(huì)有更多應(yīng)用于活體成像領(lǐng)域和跨學(xué)科研究的機(jī)會(huì)。

TPI 產(chǎn)品

圖5：本工作中所用到的特勵(lì)達(dá)普林斯頓儀器產(chǎn)品 NIRvana-HS

本工作中的科研與研發(fā)人員在采集信號(hào)時(shí)使用了來(lái)自特勵(lì)達(dá)普林斯頓儀器的NIRvana-HS近紅外相機(jī)。該相機(jī)基于InGaAs芯片開(kāi)發(fā)，采用全金屬密封的真空腔、先進(jìn)的深度制冷技術(shù)和強(qiáng)大的噪聲抑制算法，確?？蒲腥藛T獲得出色的數(shù)據(jù)。NIRvana-HS為NIRvana家族中幀速最高的產(chǎn)品。如果您的實(shí)驗(yàn)需要高幀速紅外相機(jī)，NIRvana-HS將是您的不二之選。

審核編輯 黃宇