單分子水平的蛋白質(zhì)分析揭示了集合平均技術(shù)所掩蓋的異質(zhì)性行為。酶的數(shù)字量化通常涉及通過熒光底物的轉(zhuǎn)換來觀察和計算分成微區(qū)的單分子。然而，這種基于線性信號放大的策略僅限于周轉(zhuǎn)率足夠高的少數(shù)酶。

近期，來自法國巴黎物理化工學(xué)院 - 巴黎文理研究大學(xué)（ESPCI Paris-PSL Research University）的研究人員提出了一種基于分子編程和液滴微流控的替代性技術(shù)，用于對各種DNA和RNA加工酶進行數(shù)字檢測。相關(guān)研究成果以“Functional analysis of single enzymes combining programmable molecular circuits with droplet-based microfluidics”為題發(fā)表在Nature Nanotechnology期刊上。

該研究利用一種被稱為可編程超靈敏分子放大器（PUMA）的通用分子電路，該電路對DNA信號進行閾值指數(shù)放大，并與各種輸入活動相耦合。PUMA包括一個轉(zhuǎn)換模塊，該模塊將目標(biāo)（此處為酶活性）與短DNA信號鏈的產(chǎn)生聯(lián)系起來，還包括一個DNA-酶擴增系統(tǒng)，該系統(tǒng)最終會產(chǎn)生強烈的熒光讀數(shù)。DNA-酶擴增系統(tǒng)由三個DNA模板組成：利用DNA聚合酶（Vent（exo-））和切口酶（Nb.BsmI）構(gòu)成自動催化模板，實現(xiàn)催化信號鏈的指數(shù)復(fù)制；假模板使一部分信號鏈?zhǔn)Щ睿瑥亩鸬酱呋鞯淖饔?，以避免由滲漏反應(yīng)引起的非特異性、非靶標(biāo)依賴性擴增；而前熒光報告模板（rT）與信號鏈雜交，聚合后產(chǎn)生熒光信號。

此外，研究人員設(shè)計了一個轉(zhuǎn)換模塊，將擴增開關(guān)連接到用于診斷應(yīng)用的缺口酶Nt.BstNBI（簡稱NBI）活性，以便用于診斷。研究人員在NBI濃度增加的情況下實時監(jiān)控反應(yīng)。正如預(yù)期的那樣，目標(biāo)濃度越高，信號鏈的產(chǎn)生越快，因此指數(shù)擴增開始得越快。該方法的整體靈敏度約為1μ/ml（每毫升毫單位，即約400 fM的活性酶），比基于熒光底物線性轉(zhuǎn)化的分析低四個數(shù)量級。

圖1 NBI缺口酶活性的檢測原理

利用基于PUMA的檢測的高靈敏度特性，研究人員設(shè)想了一種通用方法，稱為數(shù)字PUMA（dPUMA），用于單一酶的計數(shù)。為了對此進行評估，研究人員在NBI電路中加入不同濃度的目標(biāo)酶，然后分成單分散的微滴，通過終點熒光顯微鏡對這些微滴進行擴增和分析。通過量化陽性液滴的比例并假設(shè)隨機、泊松分布（方法），確定了活性酶的濃度，發(fā)現(xiàn)在廣泛的稀釋系列中，活性酶的濃度與初始輸入濃度成比例，證實了該酶的準(zhǔn)確數(shù)字檢測。這種dPUMA工作流程可以與所有一鍋法分析兼容，并適用于多種酶活性分子的絕對定量。引人注目的是，數(shù)字讀數(shù)顯示催化活性酶的濃度大大低于總酶濃度（由制造商提供），有時低幾個數(shù)量級。在排除了可能的實驗假象（如乳化過程中酶的失活或損失或大量污染蛋白的存在）后，研究人員得出結(jié)論，樣品確實包含大量非功能性酶，這可能源于蛋白質(zhì)生產(chǎn)、純化和/或儲存過程中的失活。

圖2 DNA相關(guān)酶的數(shù)字檢測

為了進一步研究酶混合物的組成和進化，研究人員使用實時版本的dPUMA方案評估了理論上相同的多肽庫（商業(yè)NBI）的活性分布。研究人員乳化了不同酶濃度的樣品，以測量不同泊松參數(shù)（λ）下的活性分布。每個被占據(jù)的液滴內(nèi)的起始時間被用作酶活性的代表：酶活性越強，擴增越快，這一假設(shè)被批量測量中起始時間和酶活性之間的單調(diào)關(guān)系所證實。從圖3f可以看出，在低λ（＜2）下的擴增時間較窄，這使得區(qū)分不同占有率（一種、兩種、三種或四種酶）的液滴尖峰成為可能。研究人員驗證了活性分布由高斯函數(shù)的和進行了令人滿意的擬合，這些高斯函數(shù)各自的權(quán)重受每個樣本中λ測量值的泊松頻率的約束。液滴占有率和泊松定律之間的一致性證明了通過數(shù)字分析測得的低活性分?jǐn)?shù)不是由于酶的非泊松分布（這可能發(fā)生在聚集或結(jié)合到基因組DNA長片段的酶中）。重要的是，含有單一酶的液滴中的開始時間分布的變異系數(shù)僅為17%，這表明活性酶池具有相當(dāng)均勻的活性分布。

圖3 通過延時實驗評估多肽庫活性分布

為了探索無活性組分的來源，研究人員評估了在各種應(yīng)激條件下活性分布是如何受到影響的：包括熱休克步驟的物理應(yīng)激或化學(xué)應(yīng)激。對于第一種情況，觀察到隨著熱休克持續(xù)時間的增加，酶的活性部分呈指數(shù)衰減。然而，殘留活性級分內(nèi)的活性分布與未處理樣品非常相似。無論熱激溫度如何，都可以觀察到這種兩種狀態(tài)的行為，其中酶要么完全活性，要么完全失活。它與先前報告中描述的災(zāi)難性變性模型的概念相一致，在該模型中，加熱的酶經(jīng)歷可逆的構(gòu)象變化，直到達到臨界點并不可逆地展開。

相反，在氧化處理過程中出現(xiàn)了一種明顯的模式：隨著H?O?濃度的增加，活性酶的比例再次下降；然而，開始時間的分布明顯偏離了未經(jīng)處理的樣品：當(dāng)氧化應(yīng)激增強時，更多的單一酶表現(xiàn)出較低但可測量的活性。因此，輕度氧化應(yīng)激導(dǎo)致一部分無活性的酶和一群具有中等活性的酶，這表明了一種機制，即活性降低的氧化底物在活性完全喪失之前是可接近的?；钚晕稽c外殘基側(cè)鏈的氧化可能會使催化袋不穩(wěn)定，影響底物識別或降低支架的穩(wěn)定性。在未處理的商業(yè)樣品中沒有觀察到這種拓寬的活性分布，表明它們包含的全長多肽的無活性部分可能與折疊/聚集問題有關(guān)，而不是與化學(xué)損傷有關(guān)。

圖4 酶群體的功能異質(zhì)性研究

綜上所述，研究人員通過將指數(shù)分子放大器的靈敏度與DNA酶電路和液滴讀數(shù)的模塊化相結(jié)合，可以在單分子水平上特異性地檢測幾乎所有與 D(R)NA相關(guān)的酶活性。這種被稱為數(shù)字PUMA（可編程超靈敏分子放大器）的策略已在十多種不同的酶中得到驗證，其中包括許多催化速率較慢的酶，甚至達到了化膿性鏈球菌Cas9表觀單次周轉(zhuǎn)的極限。數(shù)字計數(shù)法能獨特地獲得絕對摩爾定量，并能在所有測試的商業(yè)制劑中發(fā)現(xiàn)大量非活性催化劑。通過實時監(jiān)測單個酶分子的放大反應(yīng)，研究人員還提取了催化劑群體的活性分布，揭示了各種壓力下的其他失活途徑。該方法極大地擴展了可受益于單分子分辨率量化和功能分析的酶的數(shù)量。因此，數(shù)字PUMA 有望成為診斷或生物技術(shù)應(yīng)用中精確酶定量的多功能框架。此外，這種數(shù)字測定方法還可用于研究蛋白質(zhì)功能異質(zhì)性的起源。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41565-024-01617-1