圖 1.(a) CARS [3] 和 (b) 多路復(fù)用 CARS的能量示意圖，顯示接地、虛擬和振動狀態(tài)。對于多路復(fù)用 CARS，通過用寬帶超連續(xù)脈沖代替窄帶斯托克斯光束來獲得多種振動模式。

概述

流行的分子成像技術(shù)只能揭示人體內(nèi)用色素或熒光蛋白標(biāo)記的特定分子的分布或行為。然而，拉曼光譜允許研究人員通過光譜分析來識別未標(biāo)記分子的成分。因此，振動(拉曼)光譜通常被稱為分子指紋圖譜。使用這種無標(biāo)記分子成像增加了發(fā)現(xiàn)體內(nèi)意外變化和異常的可能性。

一種基于拉曼的創(chuàng)新技術(shù)，稱為超多重 CARS 光譜成像，在實驗和臨床應(yīng)用中展示了小型化、無創(chuàng)、實時和細(xì)胞級分子診斷的巨大實用性。這項技術(shù)能夠通過在寬光譜范圍內(nèi)同時收集的定量光子數(shù)據(jù)來觀察和分析生物結(jié)構(gòu)和過程，并且正在不斷改進和改進。

例如，日本筑波大學(xué)的 Hideaki Kano 副教授和他的同事最近對活細(xì)胞(18 種顏色對應(yīng) 18 個波數(shù))進行了超多路 CARS 光譜成像，每像素的有效曝光時間為 1.8 毫秒，這是迄今為止報道的光譜覆蓋范圍~3000 厘米-1.2

CARS 基礎(chǔ)知識

相干反斯托克斯拉曼散射 (CARS) 得名于這樣一個事實，即這種非線性光譜技術(shù)不是使用傳統(tǒng)的單個激光器，而是利用一對非常強的相干激光束照射樣品，從而產(chǎn)生反斯托克斯頻率信號。雖然第一個激光器的頻率通常是恒定的，但第二個激光器的頻率可以調(diào)整，以使兩個激光器之間的頻率差等于感興趣的拉曼活性模式的頻率。這種特殊模式將是拉曼信號中唯一極強的峰。

CARS 比正常拉曼發(fā)射強幾個數(shù)量級。執(zhí)行 CARS 不一定需要光柵;如果寬帶干涉濾光片后面放置了檢測器，則可能會起作用。接下來介紹了 CARS 的數(shù)學(xué)和示意圖描述。參見圖 1a。

兩個頻率為哦1 和哦2(哦1>哦2 )相干相互作用以產(chǎn)生頻率較高的強散射光2 小時1-哦2.如果兩個激光器之間的頻率差 (哦1-哦2 ) 等于頻率哦m拉曼活躍的振動、旋轉(zhuǎn)或其他模式，然后是頻率。

換句話說，為了獲得強拉曼信號，應(yīng)以這樣的方式調(diào)整第二個激光頻率哦2= 哦1-哦m.那么強散射光的頻率將是2 小時1-哦2= 2 小時1- (哦1-哦m) = ω1+ 哦m，它高于激勵頻率。

除了克服大多數(shù)生物分子的低信號強度外，CARS 還提供定向發(fā)射和窄光譜帶寬，不受自發(fā)熒光的干擾。CARS 研究包括微生物細(xì)胞、真核細(xì)胞、捕獲細(xì)胞、醫(yī)學(xué)組織、上皮組織、肌肉組織、神經(jīng)組織、肺組織、乳腺組織、骨骼和皮膚。

CARS 顯微鏡的快速掃描功能對于研究實時動力學(xué)的研究人員來說非常寶貴。此外，與熒光顯微鏡技術(shù)相反，細(xì)胞可以在 CARS 中重復(fù)成像，而不會因光漂白而出現(xiàn)褪色問題。

多路復(fù)用 CARS 和超多路復(fù)用 CARS

多重 CARS(見圖 1b)是一種增強型 CARS 技術(shù)，它采用多通道檢測器(例如，科學(xué)級 CCD 或 CMOS 相機)與光譜儀耦合，以覆蓋相干拉曼信號的寬光譜范圍。

通過使用寬帶激光源(例如，超連續(xù)光源或飛秒激光源)代替可調(diào)諧激光 ω2，多路復(fù)用 CARS 信號的典型頻譜覆蓋范圍可以進一步擴展，達到約 3000 厘米-1.這種超多重 CARS 光譜成像方法足夠廣泛，可以檢測所有振動基本模式——包括至關(guān)重要的指紋區(qū)域(在該區(qū)域可以識別未知有機化合物并相互區(qū)分)以及 C-H 和 O-H 拉伸區(qū)域(有助于識別脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的粗略分子分布)。

新的超多重 CARS 實驗

2000 年春天，當(dāng) Hideaki Kano 博士作為博士生參加在舊金山舉行的 CLEO 會議時，他被使用光子晶體光纖生成超連續(xù)譜所吸引，這種光纖只需要飛秒激光振蕩器即可產(chǎn)生超連續(xù)譜 (SC)。后來，在東京大學(xué)的濱口實驗室開始了他的學(xué)術(shù)生涯后，他開發(fā)了一種利用 SC 生成的國產(chǎn)逆拉曼光譜系統(tǒng)(現(xiàn)在通常被稱為受激發(fā)拉曼損耗或 SRL)光譜系統(tǒng)。

在他的實驗過程中，Kano 博士碰巧發(fā)現(xiàn)了 CARS 信號，它非常強烈，實際上比反向拉曼(即 SRL)信號更容易檢測。他很快意識到，將 SC 生成與光譜儀相結(jié)合不僅在基礎(chǔ)光譜學(xué)領(lǐng)域，而且在光譜成像剛剛興起的生命科學(xué)領(lǐng)域也將是一個突破。

實驗裝置

Kano 博士的實驗裝置中集成了兩個激光源，以及具有超高 NIR 靈敏度的新型高讀出速度 CCD 相機和高通量光譜儀。參見圖2。

第一個基于主振蕩器光纖放大器 (MOFA) 配置的激光源涉及一個微芯片振蕩器——一種包含 Nd：YVO 的無源 Q 開關(guān)激光器4晶體與可飽和吸收鏡和摻鐿光纖放大器鍵合。第二個來源是無源 Q 開關(guān)微芯片 Nd：YAG 激光器。研究人員能夠根據(jù)所研究的樣品類型切換激光源，從而在波長、時間持續(xù)時間、重復(fù)頻率和輸出平均功率方面提供良好的實驗靈活性。

圖 2.超多重光譜 CARS 系統(tǒng)。禮貌筑波大學(xué) Hideaki Kano 博士;改編自 OSAContinuum， 1693-1705 (2019)。

與 Kano 博士和他的同事在之前對活細(xì)胞進行超多重 CARS 光譜成像研究時使用的最先進的 CCD 相機相比，新推出的科學(xué) CCD 相機提供的 NIR 靈敏度要高得多。

除了在重要的 NIR 活體成像波長下具有更高的靈敏度外，這款新相機還提供了與 Kano 博士時間分辨研究中使用的超快激光器同步所需的高速操作。研究人員將相機與高通量光譜儀耦合，該光譜儀分散鏡頭收集的 CARS 信號以供相機檢測。

在用于對活細(xì)胞進行成像之前，首先通過測量聚苯乙烯珠(直徑：10 μm)的 CARS 信號來評估實驗系統(tǒng)。在 600 cm 范圍內(nèi)檢測到微珠的超多重 CARS 信號-1至 3600 厘米-1跟分辨率 <10 cm-1.像素停留時間為 ~1 毫秒，從微珠中采集了 161 × 161 個像素的 CARS 圖像，總數(shù)據(jù)采集時間為 ~28 秒(圖 3)。

圖 3.苯環(huán)呼吸振動模式下的 CARS 圖像 (1003 cm-1)在不同的深度位置;圖像是利用被動Q 開關(guān)微芯片 Nd：YAG 激光器和 CCD 相機獲得的。分辨率為161 × 161 像素，總數(shù)據(jù)采集時間為 ~28 秒，盡管使用低成本的 Microchip 激光源。2由 Tsukuba 的 Hideaki Kano 博士提供大學(xué);首次發(fā)表于 OSA Continuum 2，1693-1705 (2019)。

活 A549 細(xì)胞的成像

在通過對聚苯乙烯珠子進行成像驗證系統(tǒng)的性能后，研究人員使用高速、高靈敏度的 CCD 相機和 MOFA 激光源對活細(xì)胞 (A549) 進行了成像(圖 4)。在2850 厘米-1在光譜上，以紅色渲染的亮點對應(yīng)于單元內(nèi)的一個亮點，而該亮點又對應(yīng)于中文2拉伸振動模式主要在細(xì)胞內(nèi)脂滴中觀察到。請注意，原始 CARS 信號由振動諧振信號和非諧振背景組成。這兩個組件相互干擾并產(chǎn)生分散的線形。

圖 4.(a) A549 細(xì)胞的光學(xué)圖像;(b) 2850 cm 處的 CARS 強度映射-1;(c) 在 (b) 中的兩個位置使用紅色和藍色叉表示的原始 CARS 信號的頻譜分布。圖像是使用 MOFA 激光源獲得的和 CCD 相機。由筑波大學(xué)的 Hideaki Kano 博士提供;第一發(fā)表于 OSA Continuum 2，1693-1705 (2019)。

接下來，Kano 博士和他的同事通過進行數(shù)值分析提取純振動共振信號，以獲得自發(fā)拉曼等效光譜圖。他們發(fā)現(xiàn)這些所得光譜圖譜的主要特征分別與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的主要特征非常一致。十幾個特征拉曼帶之間3427 厘米-1和 1009 厘米-1對應(yīng)于振動模式。

有關(guān)本研究的其他數(shù)據(jù)和更詳細(xì)的討論，請參閱以下文章：Hideaki Kano、Takumi Maruyama、Junko Kano、Yuki Oka、Daiki Kaneta、Tiffany Guerenne、Philippe Leproux、Vincent Couderc 和 Masayuki Noguchi，“具有 1 毫秒像素停留時間的超多路復(fù)用 CARS 光譜成像”，OSA Continuum 2,1693-1705 (2019)。

進展與展望

研究人員進行了超多重 (600 cm-1- 3600 厘米-1) 對活細(xì)胞進行 CARS 光譜成像，報告了光譜范圍為 ~3000 cm 的寬帶 CARS 迄今為止的最快時間-1.基于清晰的分子指紋，Kano 博士和他的同事可視化了具有超過 15 個振動帶的細(xì)胞內(nèi)分子分布。在軟件上 1 毫秒的曝光時間相當(dāng)于每個像素的有效曝光時間為 ~1.8 毫秒，與 Kano 博士之前關(guān)于活細(xì)胞成像的研究(其中每個像素的曝光時間為 50 毫秒)相比，這是一個顯著的減少。這種改進主要歸功于新推出的 CCD 相機更高的靈敏度和讀出速度。2,7

這種高速技術(shù)與多變量分析方法的結(jié)合可以幫助生命科學(xué)家和醫(yī)生獲得對細(xì)胞內(nèi)代謝活動動態(tài)的有意義的見解。Kano 博士的研究小組目前正在與一名病理學(xué)家合作，使用分子指紋開發(fā)一種新的光譜診斷工具。

關(guān)鍵技術(shù)

為了促進他們最近的工作，研究人員選擇了Teledyne 普林斯頓儀器 BLAZE?相機采用專有的“超深耗盡型”CCD，由高電阻率塊狀硅制成8.該相機旨在產(chǎn)生任何可用硅器件中最高的近紅外量子效率，采用背照式 1340 x 400 光譜陣列格式(20 μm 方形像素)，能夠在空氣中冷卻至 -95°C，無需冷卻器或液體輔助，可實現(xiàn)低暗電流性能。

BLAZE 還為研究人員提供了 CCD 相機中最快的 ADC 速度。新傳感器平臺的雙 16 MHz 讀出端口經(jīng)過精心設(shè)計，可在完全垂直合并的情況下實現(xiàn)前所未有的超過 1600 個光譜/秒的光譜速率，在動力學(xué)模式下運行時高達 215 kHz。

與 BLAZE 相機配合使用的光譜儀是 Teledyne Princeton Instruments LS-785。由于其快速 f/2 光學(xué)系統(tǒng)和專有的 AR 涂層鏡頭可實現(xiàn)最佳近紅外透射，LS-785 可以實現(xiàn)高達 4 倍的標(biāo)準(zhǔn) f/4 反射光譜儀的吞吐量。CCD 相機和基于鏡頭的光譜儀的所有功能和定時均在實驗裝置中通過 Teledyne 普林斯頓儀器 LightField?64 位軟件。

審核編輯 黃宇