RRS的能級(jí)過(guò)程，分子被入射光激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)

拉曼信號(hào)十分的微弱。為了讓拉曼技術(shù)更加方便易用，許多研究者致力于研究如何增強(qiáng)拉曼信號(hào)。拉曼信號(hào)增強(qiáng)主要是通過(guò)改變樣本制備方式，更改激發(fā)方式來(lái)實(shí)現(xiàn)的，以下是幾種常見的增強(qiáng)型拉曼技術(shù)。

一，共振拉曼增強(qiáng)(RRS)

共振拉曼光譜是常規(guī)拉曼光譜的一個(gè)變種，對(duì)于共振拉曼而言，需要仔細(xì)挑選激發(fā)波長(zhǎng)，使得激光光子能量與某個(gè)電子躍遷的能量相等或者相近，一般而言位于紫外-可見吸收區(qū)域。這種共振將導(dǎo)致拉曼散射的強(qiáng)度增大102-106倍，因此，檢測(cè)限會(huì)更低，測(cè)量時(shí)間也會(huì)顯著減少。對(duì)于一些特殊的應(yīng)用而言，共振拉曼的益處很多，一個(gè)典型的例子是利用共振拉曼來(lái)分析環(huán)境污染物，通常，共振拉曼可以檢測(cè)到濃度低至ppm～ppb范圍的微量污染物。

當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)小于270nm的時(shí)候，分子會(huì)被激發(fā)到激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)的高層態(tài)，然后當(dāng)發(fā)生熒光時(shí)，分子會(huì)先通過(guò)非輻射躍遷弛豫到電子激發(fā)態(tài)的底層，再向下躍遷產(chǎn)生熒光。而對(duì)于拉曼過(guò)程，不存在由非輻射躍遷過(guò)程，因此拉曼信號(hào)的波長(zhǎng)比熒光信號(hào)的波長(zhǎng)短，因此可以使用濾光片有效的去除熒光信號(hào)的影響。此外，對(duì)于大生物分子，共振吸收通常會(huì)發(fā)生在大分子的某一個(gè)官能團(tuán)，這里稱之為發(fā)色團(tuán)。因而RRS可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大分子中某個(gè)發(fā)色團(tuán)的研究而不被周圍其他分子影響。

不過(guò)由于RRS的激光光源一般是采用紫外光，所以對(duì)整個(gè)系統(tǒng)的玻璃材質(zhì)，鍍膜都會(huì)有特殊需求，所以相對(duì)成本較高，此外并且紫外激光器相對(duì)更大型、更復(fù)雜，也更加昂貴，目前紫外拉曼實(shí)驗(yàn)依然屬于高端技術(shù)，需要高水平專業(yè)技術(shù)人員操作。最后由于紫外光子的能量更高，在紫外激光照射下樣品更易于燒壞或者降解，生物樣本也更容易產(chǎn)生變異。下圖是RRS的簡(jiǎn)要優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比圖：

二，表面共振增強(qiáng)型拉曼(SERS)

SERS是一種非常靈敏的探測(cè)技術(shù)，它能夠顯著的增強(qiáng)微弱的拉曼信號(hào)，允許在極低的樣品濃度下探測(cè)樣品的存在、結(jié)構(gòu)等。

SERS使用通常的拉曼光譜法測(cè)定吸附在膠質(zhì)金屬顆粒如銀、金或銅表面的樣品，或吸附在這些金屬片的粗糙表面上的樣品。SERS現(xiàn)象首先是由英國(guó)科學(xué)家Fleischmann在1974年發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)時(shí)他發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙的銀電極表面的吡啶拉曼信號(hào)增強(qiáng)。1997年學(xué)者Kneipp與Nie成功的實(shí)現(xiàn)了單分子級(jí)別拉曼探測(cè)，從此SERS成為了非常流行的探測(cè)技術(shù)。

SERS的增強(qiáng)原理

SERS能夠提高拉曼信號(hào)主要是有兩個(gè)機(jī)制，一是電磁場(chǎng)增強(qiáng)，一個(gè)是化學(xué)增強(qiáng)。電磁場(chǎng)被認(rèn)為是最主要的增強(qiáng)貢獻(xiàn)，當(dāng)激光入射到金屬納米顆粒的時(shí)候，會(huì)發(fā)生等離子效應(yīng)，在納米顆粒周圍的電場(chǎng)會(huì)顯著增強(qiáng)，因而附著在納米顆粒表面的待測(cè)分子的拉曼信號(hào)就會(huì)因此顯著提高。電磁場(chǎng)增強(qiáng)效應(yīng)可以提高拉曼信號(hào)約1萬(wàn)倍。由于Cu, Ag和Au 3種IB族金屬的d電子和s電子的能隙和過(guò)渡金屬相比較大, 在可見光與近紅外激光激發(fā)的情況下，它們不易發(fā)生帶間躍遷。便可避免因發(fā)生帶間躍遷而將吸收光的能量轉(zhuǎn)化為熱等, 從而趨向于實(shí)現(xiàn)高效SPR散射過(guò)程。因而Cu, Ag和Au是目前最主要使用的SERS基質(zhì)金屬。對(duì)于化學(xué)效應(yīng)，待測(cè)分子與金屬發(fā)生了電荷轉(zhuǎn)移，從而更改了待測(cè)分子的能級(jí)結(jié)構(gòu)，可以實(shí)現(xiàn)共振激發(fā)，提高拉曼信號(hào)?；瘜W(xué)效應(yīng)可以提高拉曼信號(hào)約10-100倍。

由于SERS技術(shù)可以顯著的提高拉曼信號(hào)的強(qiáng)度，因而SERS技術(shù)對(duì)于激發(fā)光源，探測(cè)器的要求就會(huì)大幅度降低。這使拉曼設(shè)備的小型化成為了可能。如下圖是濱松生產(chǎn)的SERS模塊C13560，它的尺寸只有80*60*12.5mm3，重量只有80g，相比于其它重達(dá)幾十千克的科學(xué)拉曼設(shè)備，C13560具有非常高的便攜性，非常適合那些對(duì)便攜性要求高的場(chǎng)合，比如毒品檢測(cè)，污水檢測(cè)等。

SERS技術(shù)的核心關(guān)鍵就是SERS基質(zhì)的制備。SERS基質(zhì)的主要問(wèn)題包括有信號(hào)增強(qiáng)不均勻，基質(zhì)壽命短，成本高等缺點(diǎn)。因此目前SERS基質(zhì)發(fā)展主要是有兩個(gè)方向：1是提高增強(qiáng)的均勻性，2是降低成本，降低基質(zhì)制備要求與制備時(shí)間，實(shí)現(xiàn)基質(zhì)的立等可取。對(duì)于前者，目前采用的主要手段是納米印刷技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)金屬納米顆粒高度均勻的分布，從而可以實(shí)現(xiàn)高度均勻的拉曼增強(qiáng)，此外介質(zhì)的壽命也可以做到長(zhǎng)達(dá)半年。對(duì)于后者目前主要的手段分為兩種，一種是采用打印技術(shù)，將納米顆粒溶液放到打印機(jī)的墨盒中，可以將納米顆粒打到印到紙張上，可以非常高效率的完成SERS基質(zhì)的制備。還有一種是基于電流位移的技術(shù)。在金屬片比如鋁片上涂上還有銀離子的溶液，鋁會(huì)把銀離子還原，從而銀就以比較粗糙的形式附著在了金屬片上。這兩種制備方法都具備實(shí)驗(yàn)條件要求低，成本地，速度快，立等可取的優(yōu)點(diǎn)。從另外一個(gè)角度解決了SERS壽命短的問(wèn)題。

三種SERS基質(zhì)制備技術(shù)的對(duì)比

三，針尖增強(qiáng)拉曼技術(shù)(TERS)

TERS實(shí)際上也是基于表面等離子增強(qiáng)效應(yīng)。不過(guò)與SERS不同，TERS并不是使用粗糙的金屬基質(zhì)來(lái)增強(qiáng)拉曼信號(hào)，而是使用一根靠近樣品的極細(xì)的金屬針尖來(lái)增強(qiáng)針尖附近的拉曼信號(hào)。

TERS系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)

TERS技術(shù)一般是基于原子力顯微鏡搭建的。通過(guò)將原子力顯微鏡(AFM)的針尖包覆SERS活性金屬或金屬納米粒子(Ag, Al, Au等)使其具有SERS活性，那么SERS增強(qiáng)效應(yīng)將可望只在針尖附近很小范圍發(fā)生。TERS實(shí)驗(yàn)通常需要將激發(fā)激光束通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡物鏡聚焦，從而產(chǎn)生在衍射極限0.5 ~ 1.0微米范圍內(nèi)尺寸的光斑(具體大小依賴于激發(fā)激光波長(zhǎng)和所使用的物鏡);然后使具有SERS活性的針尖與激光光斑范圍內(nèi)的樣品接觸。

這里主要有兩種類型的拉曼散射過(guò)程：

1.來(lái)自衍射極限0.5 ~ 1.0微米激光光斑范圍內(nèi)的常規(guī)拉曼散射。

2.來(lái)自針尖的表面增強(qiáng)拉曼散射(即針尖增強(qiáng)拉曼散射)。

由于SERS給出的拉曼強(qiáng)度增強(qiáng)可高達(dá)1014-1015倍，那么TERS強(qiáng)度可以認(rèn)為遠(yuǎn)超過(guò)常規(guī)拉曼信號(hào)強(qiáng)度。因此可以認(rèn)為拉曼信號(hào)僅僅來(lái)自于針尖附近的樣本。因此在光斑范圍內(nèi)掃描針尖的移動(dòng)，就可以得到光斑內(nèi)的顯微拉曼。由于針尖的尺度一般都小于100 nm，所以這種測(cè)量的空間分辨率也將相應(yīng)地小于100 nm，從而實(shí)現(xiàn)真正納米尺度的拉曼。當(dāng)然，因?yàn)榕c常規(guī)拉曼分析相比，TERS所取樣的分子數(shù)目相應(yīng)地也減少了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，所以并不能保證所有的樣本都可以成功的實(shí)現(xiàn)TERS。下圖展示了TERS基本的實(shí)驗(yàn)構(gòu)型與針尖的大小。

TERS可以具有可以實(shí)現(xiàn)單分子探測(cè)，具有很高的分辨率(<100nm)的優(yōu)點(diǎn)，但是因?yàn)門ERS一般需要與AFM相結(jié)合，系統(tǒng)比較復(fù)雜，因此應(yīng)用一般局限在實(shí)驗(yàn)室中，而不能像SERS一樣有機(jī)會(huì)發(fā)展為手持設(shè)備。此外TERS技術(shù)所用的針尖也容易損壞，表面鍍的活性金屬液容易脫落，進(jìn)一步提高了TERS實(shí)驗(yàn)的難度。下圖總結(jié)了TERS的優(yōu)缺點(diǎn)：

四，相干拉曼散射技術(shù)(CRS)

與前面幾種拉曼增強(qiáng)技術(shù)只使用一個(gè)波長(zhǎng)激發(fā)不同，CRS技術(shù)需要使用兩個(gè)波長(zhǎng)的光源對(duì)樣本進(jìn)行激發(fā)。CRS也可以大概提高信號(hào)106倍，目前已經(jīng)成為一種常見的非線性顯微技術(shù)。

CRS分為兩種類型，一種是相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)，另外一種是受激拉曼散射(SRS)。在CRS技術(shù)中，兩束頻率分別為wp與ws的光在空間上重合然后通過(guò)物鏡匯聚到樣本上。當(dāng)兩束光的頻率差與分子振動(dòng)的能級(jí)相同的時(shí)候，就會(huì)發(fā)生CARS與SRS過(guò)程，對(duì)于CARS過(guò)程，兩束光與樣本相互作用，產(chǎn)生頻率為2wp-ws的CARS信號(hào)。而對(duì)于SRS過(guò)程，兩束光與樣本相互作用，wp的能量會(huì)轉(zhuǎn)移到ws光上。下圖為CARS與SRS過(guò)程對(duì)應(yīng)的能級(jí)圖：

CRS的能級(jí)過(guò)程，與自發(fā)拉曼不同，CRS需要兩束入射光

雖然CRS可以顯著的提高拉曼信號(hào)強(qiáng)度，但是相比于普通熒光信號(hào)，受激界面仍然較弱，因而激光光源常采用飛秒、皮秒光源來(lái)提高收集效率。為了提高穿透深度，光源一般采用近紅外光，所以摻鈦藍(lán)寶石飛秒激光器+OPO等超快光源是主流的CRS光源。

對(duì)于CARS技術(shù)，由于CARS信號(hào)仍然較微弱，所以產(chǎn)生的信號(hào)一般是經(jīng)過(guò)濾光片濾除激發(fā)光以后直接使用PMT進(jìn)行探測(cè)，由于CARS信號(hào)一般位于600-800nm區(qū)間，所以具有較好的可見與紅外響應(yīng)的多堿，GaAsP類型的PMT成為CARS技術(shù)的首選PMT,比如濱松的R3896，H7422p-40等。

而對(duì)于SRS過(guò)程，由于SRS信號(hào)本身與激發(fā)光源的波長(zhǎng)一致，所以無(wú)法使用PMT進(jìn)行探測(cè)，為了能夠?qū)崿F(xiàn)探測(cè)，常采用的方法是基于調(diào)制器與鎖相放大器的調(diào)制與解調(diào)方法。以使用816nm與1064nm激光探測(cè)生物樣本中油脂的SRS實(shí)驗(yàn)為例[見下圖]。使用電光調(diào)制器或者聲光調(diào)制器調(diào)制1064nm激光的強(qiáng)度，調(diào)制頻率為20MHZ，則由于SRS過(guò)程，在經(jīng)過(guò)了樣本之后，816nm的強(qiáng)度也發(fā)生了調(diào)制(有1064nm時(shí)，816nm強(qiáng)度減弱，沒有1064nm時(shí)，816nm強(qiáng)度不變)，調(diào)制的深度即為SRS信號(hào)的強(qiáng)度。經(jīng)過(guò)帶通濾波片使用光電二極管探測(cè)816nm信號(hào)，然后將二極管探測(cè)的信號(hào)輸入到鎖相放大器，就可以得到816nm的調(diào)制深度，從而得到SRS信號(hào)的強(qiáng)度。

SRS技術(shù)的實(shí)驗(yàn)裝置與SRS信號(hào)探測(cè)的方法

CRS技術(shù)非常適合用于顯微成像，可以實(shí)現(xiàn)視頻級(jí)的速度。不過(guò)由于CRS一次成像只是得到一個(gè)波數(shù)的圖像，因此更適合那種拉曼峰特別明顯的樣本。如果想要得到與顯微拉曼類似的數(shù)據(jù)(每個(gè)像素都包含有拉曼光譜)，則需要掃描兩束及發(fā)光的波長(zhǎng)差，則CRS的時(shí)間優(yōu)勢(shì)會(huì)變得稍微不明顯。下面是CRS技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)：

審核編輯 黃宇