體內(nèi)拉曼光譜學(xué)

拉曼光譜是生命科學(xué)和生物技術(shù)中一項(xiàng)重要的測(cè)量技術(shù)，涵蓋從分析單一生化分子結(jié)構(gòu)的納米級(jí)實(shí)驗(yàn)到疾病檢測(cè)和組織性質(zhì)監(jiān)測(cè)。生命科學(xué)研究中的拉曼光譜學(xué)家在紫外(UV)到近紅外(NIR)和短波紅外(SWIR)區(qū)域使用激發(fā)和檢測(cè)，激光激發(fā)波長(zhǎng)的選擇是平衡光譜分辨率、檢測(cè)效率和避免自熒光背景的重要實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

近年來，拉曼光譜在臨床和體內(nèi)光譜中的應(yīng)用顯著增長(zhǎng)，因其在監(jiān)測(cè)疾病、惡性組織檢測(cè)、冠狀動(dòng)脈鈣化和炎癥方面的診斷潛力已被證明。拉曼光譜的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)是速度快且能夠進(jìn)行無標(biāo)記測(cè)量。結(jié)果通常在幾秒內(nèi)即可獲得，分子特異性極高，無需特殊樣品制備或光學(xué)標(biāo)記。

自發(fā)拉曼散射是一種弱效應(yīng)，僅影響十分之一的現(xiàn)象6-108入射光子，需要能夠探測(cè)極低信號(hào)水平的靈敏相機(jī)。不幸的是，生物組織上的應(yīng)用往往無法通過增加激光功率來補(bǔ)償，因?yàn)榻M織可能會(huì)被大量激光輻射損傷。因此，正確選擇用于檢測(cè)拉曼信號(hào)的相機(jī)對(duì)于體內(nèi)拉曼測(cè)量至關(guān)重要。

近紅外的高靈敏度

體內(nèi)組織上的拉曼測(cè)量會(huì)受到自發(fā)熒光干擾的影響，這會(huì)遮蔽弱拉曼信號(hào)并使測(cè)量分析變得復(fù)雜。緩解自熒光的主要工具是選擇更長(zhǎng)的(近紅外)激發(fā)激光波長(zhǎng)，將拉曼信號(hào)轉(zhuǎn)移到自熒光背景影響較小或消失的光譜區(qū)域。

最常用的激發(fā)選擇是785nm或830nm激光，這兩者同時(shí)伴隨著組織中散射減少的窗口，從而實(shí)現(xiàn)更大的光學(xué)穿透深度。由于拉曼信號(hào)是作為相對(duì)于激光線的能量變化被檢測(cè)到的，相關(guān)光譜信息將位于近紅外波長(zhǎng)范圍內(nèi)。

靈敏度檢測(cè)的挑戰(zhàn)在于，隨著接近1100納米的探測(cè)極限，基于硅的探測(cè)器在近紅外的量子效率正在下降。此外，自發(fā)拉曼散射截面以1/λ的速率衰減。4與可見光激勵(lì)相比，信號(hào)強(qiáng)度顯著降低。鑒于這些挑戰(zhàn)，正確選擇檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)于體內(nèi)拉曼光譜應(yīng)用至關(guān)重要。

用于近紅外波長(zhǎng)區(qū)域的首選探測(cè)器是深度耗盡CCD，這是一種帶有更高近紅外靈敏度的背光傳感器。其耗盡區(qū)寬度明顯大于普通背光CCD，提高了在需要較長(zhǎng)平均自由程以實(shí)現(xiàn)吸收和檢測(cè)的紅波段的效率。

最近，超深耗盡相機(jī)(有時(shí)稱為HiRho CCD)發(fā)布，其近紅外靈敏度更高。圖1展示了深度耗盡“標(biāo)準(zhǔn)”CCD相機(jī)與超深度耗盡高近紅外高靈敏度相機(jī)在波長(zhǎng)增加下量子效率的比較。

圖1：CCD相機(jī)在體內(nèi)拉曼光譜學(xué)中的量子效率。條形圖分別顯示了785納米(淺藍(lán)色)和830納米(橙色)拉曼光譜相關(guān)的光譜區(qū)域。綠色區(qū)域代表重要的指紋區(qū)域。

讓我們來看看這種效率如何應(yīng)用于785nm和830nm激發(fā)波長(zhǎng)的拉曼光譜實(shí)驗(yàn)，特別是在拉曼信號(hào)可能出現(xiàn)的光譜帶內(nèi)。圖1顯示兩條條，顯示拉曼信號(hào)在785nm(藍(lán)色條)和830nm(橙色條)激發(fā)下的光譜位置。指紋區(qū)域在500-1500厘米之間-1每個(gè)案例都用綠色高亮顯示。它對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為817-889nm(785nm激發(fā))，865-948nm(830nm激發(fā)區(qū))。

當(dāng)需要進(jìn)一步降低自體熒光背景時(shí)，830nm激光激發(fā)是一種選擇，相較于785nm激發(fā)。然而，信號(hào)高波數(shù)區(qū)域的邊緣(2500-3800cm)-1)部分位于硅CCD探測(cè)器探測(cè)范圍之外的波長(zhǎng)(硅CCD探測(cè)器無法探測(cè)波長(zhǎng)超過1100納米的光，這對(duì)應(yīng)于> 2900厘米的830納米激光的能量偏移-1).

InGaAs探測(cè)器可用于該波長(zhǎng)范圍的檢測(cè)，但代價(jià)是噪聲增加了幾個(gè)數(shù)量級(jí)。事實(shí)上，對(duì)于自發(fā)熒光干擾最強(qiáng)的應(yīng)用，有些實(shí)驗(yàn)甚至使用約1064nm的更高激發(fā)波長(zhǎng)，以進(jìn)一步將期望信號(hào)與干擾背景的光譜區(qū)域分離。

由于信號(hào)位于硅(Si)CCD無法探測(cè)的紅外波長(zhǎng)，因此應(yīng)使用深冷卻的InGaAs相機(jī)。使用液氮或先進(jìn)熱電冷卻的深度冷卻能有效減少熱噪聲，從而提升InGaAs相機(jī)的靈敏度。

從圖1可以看出，標(biāo)準(zhǔn)的深耗攝像機(jī)以及更高近紅外靈敏度的攝像機(jī)都非常適合高效檢測(cè)拉曼信號(hào)的指紋區(qū)域。然而，后者為拉曼光譜中所有相關(guān)區(qū)域提供了更好的高靈敏度覆蓋。

低噪聲與深度冷卻

弱信號(hào)要求光譜相機(jī)在低噪聲水平下工作，尤其需要較低的讀數(shù)和暗噪聲。設(shè)計(jì)良好的相機(jī)電子設(shè)備會(huì)將讀出噪聲控制在最低水平。暗噪聲是由每個(gè)像素中熱產(chǎn)生的電荷以及傳感器上入射光產(chǎn)生的電荷產(chǎn)生的。暗噪聲還會(huì)在信號(hào)中引入偏置，隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，從而增加信號(hào)中的噪聲。

光譜相機(jī)通常通過垂直分組檢測(cè)器排來作。分幀在讀出前，在串行寄存器中收集列中每個(gè)像素(即所有對(duì)應(yīng)相同波長(zhǎng)的電荷)的電荷(因此讀出噪聲只累積一次)。然而，在分選過程中，列中每個(gè)像素的暗電荷也會(huì)累積。由于通常需要分組數(shù)十甚至數(shù)百個(gè)探測(cè)器行，暗電荷的有效積累量可能比相機(jī)數(shù)據(jù)手冊(cè)中按像素計(jì)算的數(shù)值大出數(shù)量級(jí)。因此，用于體內(nèi)拉曼光譜的靈敏相機(jī)應(yīng)能在極低溫度下工作，以避免傳感器上積累暗電流。

在體內(nèi)應(yīng)用中，最常用熱電冷卻，以避免處理低溫液體。最新一代深層熱電冷卻相機(jī)可在-75°C至-95°C之間，無需任何外部設(shè)備(如液冷循環(huán)或冷卻器)。

除了熱電冷卻設(shè)計(jì)外，相機(jī)傳感器腔體的良好真空對(duì)于實(shí)現(xiàn)低溫也非常重要。吸塵器在運(yùn)行時(shí)應(yīng)無需維護(hù)，且壽命長(zhǎng)，理想情況下應(yīng)能貫穿相機(jī)的使用壽命。

低固定模式噪聲與防折邊技術(shù)

Etalon化是由傳感器中光線干涉引起的。當(dāng)檢測(cè)到的波長(zhǎng)大于700nm時(shí)，背光CCD相機(jī)中就會(huì)發(fā)生這種現(xiàn)象，因?yàn)樘綔y(cè)材料(硅)在1100nm處接近檢測(cè)極限時(shí)變得更透明。Etaloning會(huì)表現(xiàn)為傳感器上一系列干涉條紋，在圖像和光譜上都能看到。

對(duì)于體內(nèi)拉曼光譜學(xué)，這些伊拉曼效應(yīng)進(jìn)一步復(fù)雜化了生物系統(tǒng)所顯示的背景減法和數(shù)據(jù)分析。理想的體內(nèi)拉曼光譜探測(cè)器需要減少或消除這些效應(yīng)。

針對(duì)CCD相機(jī)傳感器這些缺陷的傳感器增強(qiáng)已被廣泛應(yīng)用，不僅可以消除無向化，還能擴(kuò)大和提高傳感器的光譜靈敏度。

例如，Teledyne Princeton Instruments eXcelon 工藝設(shè)計(jì)旨在消除 etalon(見圖2)，并打造超寬帶高靈敏度 CCD 攝像機(jī)。它顯著提升了量子效率高達(dá)40%，量子電子流>從紫外到可見光的量子效率達(dá)到90%。eXcelon的設(shè)計(jì)還旨在為研究人員提供比單層或兩層AR涂層更高的性能選擇。

圖2：使用eXcelon(右圖)相較于標(biāo)準(zhǔn)背照CCD(左圖)和兩幅圖像的截面，均改善了邊緣化效果。用900nm單色光照明。

基于eXcelon技術(shù)的成功，專門為近紅外拉曼應(yīng)用，特別是體內(nèi)拉曼光譜開發(fā)了一種名為eXcelon 4的新型CCD增強(qiáng)工藝。eXcelon 4在用785nm和830nm激光激發(fā)的拉曼測(cè)量中，從低波數(shù)和指紋區(qū)到高波數(shù)區(qū)，提供了理想的抑制。

探測(cè)器尺寸

體內(nèi)拉曼測(cè)量通常使用光纖探針，探針以圓形或線性排列的纖維束。這種布置使光纖端部在信號(hào)收集側(cè)形成密集排列，并沿光譜儀入口狹縫分布在光譜儀/探測(cè)器側(cè)(見圖3)。

圖3：圓到線性纖維叢。輸入和輸出側(cè)的特寫視圖。

這種配置增加了覆蓋大面積光纖的信號(hào)收集，并優(yōu)化了與光譜儀的耦合效率，同時(shí)可保持高光譜分辨率進(jìn)行測(cè)量。(參見我們的技術(shù)說明：提升拉曼散射的收集效率)

圖4展示了通過此類光纖束采樣的原子發(fā)射燈光譜的色散圖像。纖維在垂直方向上的線性排列清晰可見。

纖維叢的不同區(qū)域可能具有不同的光譜功能。例如，空間偏移拉曼光譜(SORS)利用組織側(cè)纖維的空間排列，從地下組織區(qū)域獲得深度依賴數(shù)據(jù)。

用于體內(nèi)拉曼光譜的理想探測(cè)器應(yīng)具備足夠大的寬度和高度，以覆蓋寬廣的光譜范圍且分辨率足夠高，并且光纖束能夠容納大量光纖。光譜CCD如Teledyne、普林斯頓儀器的BLAZE和PIXIS攝像機(jī)系列，擁有寬27毫米和高8毫米的高傳感器選項(xiàng)，尺寸足夠容納數(shù)十條高光譜分辨率的光纖線路。需要注意的是，這種探測(cè)器應(yīng)與全焦平面像差低(如散光)的光譜儀配合使用。否則，光譜質(zhì)量和分辨率將因像差的引入而降低。

圖4：光譜學(xué)使用纖維束。光纖沿入口狹縫分布，提高了光耦合效率，同時(shí)保持高光譜分辨率。

摘要

用于體內(nèi)診斷測(cè)量的拉曼光譜必須應(yīng)對(duì)弱信號(hào)和大熒光背景輻射的挑戰(zhàn)。由于深度耗盡和HiRho CCD相機(jī)在近紅外中靈敏度高，是該應(yīng)用的理想探測(cè)器。最新一代相機(jī)針對(duì)體內(nèi)測(cè)量進(jìn)行了優(yōu)化，增加了以下特別硬件組件：

先進(jìn)的熱電冷卻系統(tǒng)可達(dá)到低至-95°C的溫度，無需冷卻器或液體冷卻劑

傳感器增強(qiáng)以消除光譜數(shù)據(jù)中的無光化和邊緣化現(xiàn)象

大型傳感器以幫助最大化信號(hào)收集，并實(shí)現(xiàn)高光譜分辨率

審核編輯 黃宇