熒光的共定位是當(dāng)今生物顯微成像中一個(gè)極為常見(jiàn)的技術(shù)，兩個(gè)或者更多種不同顏色的熒光探針被用來(lái)標(biāo)記不同的結(jié)構(gòu)/位點(diǎn)，使得其相互關(guān)系得以明晰地在合并的圖像上展現(xiàn)。隨著研究者對(duì)于實(shí)驗(yàn)的要求越來(lái)越高，這些熒光共定位的成像逐漸被希望能用于熒光強(qiáng)度高速變化或者樣品本身位置不斷變化的實(shí)驗(yàn)中，比如活動(dòng)的斑馬魚(yú)、線蟲(chóng)體內(nèi)兩類(lèi)神經(jīng)細(xì)胞的熒光共定位成像。在這些實(shí)驗(yàn)中，由于樣品本身是運(yùn)動(dòng)的，兩個(gè)顏色的成像時(shí)間間隔越短，越能夠反映熒光探針共定位的真實(shí)情況。

在另外一些實(shí)驗(yàn)中，同一個(gè)熒光探針的熒光顏色(波長(zhǎng))會(huì)隨著環(huán)境的變化而發(fā)生變化，那么前后兩種顏色熒光強(qiáng)度的比值就能反映出環(huán)境的變化，如Di4之于細(xì)胞膜電位，Cameleon之于Ca離子濃度等等。當(dāng)相關(guān)的環(huán)境變化速度比較快的時(shí)候，兩個(gè)顏色的成像時(shí)間間隔越短，測(cè)量也就越精確。

綜合以上兩類(lèi)成像實(shí)驗(yàn)，均是需要盡可能地將兩個(gè)不同顏色熒光信號(hào)在同一時(shí)刻拍攝下來(lái)，那么最理想的情況就是我們?cè)谶@篇Application notes中所提到的雙色同步成像，即完全同時(shí)地拍攝兩個(gè)顏色通道的熒光信號(hào)。

雙色同步成像——采用W-View GEMINI的完全同步成像

雙色同步成像最直接的思路就是用彩色相機(jī)，但如今絕大多數(shù)的彩色相機(jī)是在黑白芯片的基礎(chǔ)上將每個(gè)像素前添加濾光涂層(一般為紅、綠、藍(lán)三種，如下圖)，此彩色濾光涂層使得不同的像素可以分別得到不同的顏色信息，最后合成出彩色的圖片。這樣的設(shè)計(jì)在明場(chǎng)成像(如HE染色，免疫組化切片)中不可或缺，但對(duì)于生物熒光信號(hào)的成像卻是有缺陷的。首先，濾光涂層的出現(xiàn)會(huì)吸收或反射部分入射光信號(hào)，降低整個(gè)芯片的靈敏度，在信號(hào)本來(lái)就較弱的熒光拍攝中會(huì)影響到成像信噪比;其次，由于不同像素前存在不同顏色的濾光涂層，對(duì)于單色光信號(hào)——比如熒光信號(hào)——的實(shí)際分辨率將被降低。換句話說(shuō)，對(duì)于一臺(tái)140萬(wàn)像素的彩色CCD相機(jī)，其真正能夠檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)的像素僅有約70萬(wàn)個(gè)像素，其余的70萬(wàn)像素的綠光強(qiáng)度信息均為計(jì)算獲得(注：因?yàn)榫G色為人眼最為敏感的顏色，所以一般彩色相機(jī)中以4個(gè)像素為一組，兩個(gè)像素采用綠色涂層，其余兩個(gè)像素則分別采用藍(lán)色及紅色涂層)。更重要的，如果采用這類(lèi)彩色相機(jī)用于雙色熒光同步成像，一些顏色并不是紅綠藍(lán)三種顏色(對(duì)應(yīng)彩色相機(jī)像素上的三種濾光涂層)的熒光探針將受到極大的限制。

所以傳統(tǒng)上，許多實(shí)驗(yàn)室通過(guò)切換顯微鏡上的濾光塊轉(zhuǎn)盤(pán)或者是采用濾光輪進(jìn)行不同顏色之間的切換。但這樣無(wú)法做到完全同步拍攝兩個(gè)顏色的圖片，濾光塊轉(zhuǎn)盤(pán)的切換時(shí)間需要約1秒鐘，而濾光輪不同濾光片之間的每一次切換也需要幾十毫秒時(shí)間，事實(shí)上影響了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間分辨率，所以在比較高速的比例成像等場(chǎng)合，采用濾光輪或者濾光塊轉(zhuǎn)盤(pán)都容易造成數(shù)據(jù)的誤差。

而采用濱松W-View GEMINI則完全沒(méi)有這樣的擔(dān)心，兩個(gè)顏色的信號(hào)被成像到相機(jī)的上下兩半感光芯片上，實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)顏色成像的完全同步。

雙色同步成像——一臺(tái)Flash 4.0 LT相機(jī)作兩臺(tái)用

采用W-View GEMINI這樣的雙色分光附件將兩種顏色的信號(hào)成像到一臺(tái)相機(jī)的一個(gè)感光芯片上很好地解決了同步成像的時(shí)間問(wèn)題，但對(duì)于絕大多數(shù)的相機(jī)，整個(gè)感光芯片只能設(shè)置一個(gè)曝光時(shí)間，當(dāng)兩個(gè)顏色的信號(hào)強(qiáng)度相差較大時(shí)將很難同時(shí)將兩個(gè)顏色的成像信噪比保證在最佳狀態(tài)。

而濱松Flash 4.0 LT則可以分別調(diào)整同一芯片上下兩半的曝光時(shí)間。所以在采用W-View GEMINI配合Flash 4.0 LT的時(shí)候，我們可以非常靈活地調(diào)整兩個(gè)顏色信號(hào)的相對(duì)亮度，得到更加能夠突出所需信號(hào)和結(jié)構(gòu)的圖片。在兩個(gè)顏色通道的信號(hào)差別非常大的時(shí)候，F(xiàn)lash 4.0 LT + W-View GEMINI這種靈活的曝光時(shí)間設(shè)置就可以針對(duì)不同的波長(zhǎng)設(shè)置不同的曝光時(shí)間，同時(shí)保證兩個(gè)波長(zhǎng)信號(hào)的信噪比。

審核編輯 黃宇