以高通量方式對多種分析物進(jìn)行無標(biāo)記檢測是生物傳感應(yīng)用領(lǐng)域長期追求的目標(biāo)之一。然而，對于全光學(xué)方法而言，如何將最先進(jìn)的無標(biāo)記技術(shù)與能高通量處理小體積樣品的微流控技術(shù)以及能賦予分析特異性的表面化學(xué)技術(shù)相結(jié)合，是迄今為止面臨的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近期，來自瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院（ETH Zurich）和美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬麻省總醫(yī)院（Massachusetts General Hospital，Harvard Medical School）的研究人員提出了一種無標(biāo)記光流控（optofluidic）平臺，它將最先進(jìn)的數(shù)字全息技術(shù)與基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控技術(shù)相結(jié)合，并利用支撐性脂質(zhì)雙層膜（SLB）作為表面化學(xué)構(gòu)件，將這兩種技術(shù)融為一體。具體而言，這種光流控平臺通過具有單顆粒靈敏度的多路復(fù)用無標(biāo)記免疫親和檢測方法，實(shí)現(xiàn)了對異質(zhì)生物納米顆粒群的指紋識別。相關(guān)研究成果以“Molecular fingerprinting of biological nanoparticles with a label-free optofluidic platform”為題發(fā)表在Nature Communications期刊上。

在這項(xiàng)工作中，研究人員圍繞以下三個方面，實(shí)現(xiàn)了對異質(zhì)納米顆粒懸浮液進(jìn)行無標(biāo)記分子指紋分析的目標(biāo)：（1）單顆粒靈敏度的大視場（FOV）成像；（2）高通量、小體積和可單獨(dú)尋址的微流控通道；（3）用于拉下免疫親和檢測的片內(nèi)表面功能化方法。

圖1 無標(biāo)記光流控平臺的示意圖和工作流程

首先，為了實(shí)現(xiàn)大視場（FOV）成像，研究人員使用了反射式內(nèi)聯(lián)全息顯微鏡，由于該研究只對微流控芯片表面和固定在其上的納米顆粒之間的干涉感興趣，因此需要借助空間非相干光源來實(shí)現(xiàn)。圖1B展示了光流控平臺的光學(xué)讀出策略。作為成像區(qū)域，該研究的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)100 μm × 100 μm左右的照明FOV，由于微流控芯片中多個密接界面反射產(chǎn)生的有害寄生條紋的存在，使用高數(shù)值孔徑（NA）物鏡的干涉散射（iSCAT）顯微鏡（一種數(shù)字內(nèi)聯(lián)全息方法）很難實(shí)現(xiàn)這種效果。通過微流控芯片成像時，利用空間非相干照明除了能夠減少這些寄生干擾，還能大大降低斑點(diǎn)的影響。因此，該研究利用窄帶光纖耦合發(fā)光二極管（LED）作為光源成像到樣品上。樣品的散射光以及微流控芯片基底界面的微弱反射光被NA物鏡收集，隨后，二者之間的干涉被成像到相機(jī)上。為了擴(kuò)展FOV，研究人員按照既定的計(jì)算機(jī)視覺程序拼接了一系列光柵掃描圖像。

為了滿足小體積試劑、多路復(fù)用和通量的需求，研究人員使用了基于Quake微閥的PDMS基微流控芯片（圖1C）。這種微流控芯片由控制層（橙色）和流動層（淺藍(lán)色）組成，可獨(dú)立處理不同的傳感通道（黑色箭頭），在不受使用者操作干擾的情況下可以精細(xì)控制免疫捕獲檢測的每一步。此外，在該研究提出的微流控芯片的每個微流控通道中可以獨(dú)立進(jìn)行不同的檢測實(shí)驗(yàn)，并通過計(jì)算機(jī)界面對檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)行程序化控制，從而為實(shí)現(xiàn)免疫檢測的長期自動化提供了可能。此外，就該微流控免疫檢測平臺使用的樣品總體積而言，每個傳感區(qū)域的體積大約為10 nL（長、寬、高分別為3 mm、0.3 mm和0.01 mm），加上通道的入口和出口路徑區(qū)域，每個微流控通道的體積大約為40 nL。因此，整個微流控芯片使用的樣品量總計(jì)不到0.5 μL。

最后，在表面化學(xué)方面，為了將建立的微流控技術(shù)和成像技術(shù)結(jié)合在一起，研究人員選擇了SLB（圖1D）作為片內(nèi)功能化方案的基材，這是因?yàn)镾LB具有仿生性質(zhì)，易于制備，且具有內(nèi)在防污特性和片上兼容性。通過熔融輔助囊泡融合方法制備的SLB可以同時作為防止非特異性結(jié)合的鈍化涂層，以及免疫捕獲拉下檢測的構(gòu)件。

隨后，研究人員對構(gòu)建的光流控免疫檢測平臺的穩(wěn)健性和檢測性能進(jìn)行了表征，并將其應(yīng)用于通過表面蛋白生物標(biāo)志物對四種不同的卵巢細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡（EV）群進(jìn)行分析，從而為每種細(xì)胞系開發(fā)出獨(dú)特的生物標(biāo)志物指紋。

圖2 光流控免疫檢測平臺的重現(xiàn)性和穩(wěn)健性

圖3 多路復(fù)用細(xì)胞外囊泡（EV）指紋圖譜

綜上所述，這項(xiàng)研究提出了一種利用微流控芯片上空間相互隔離的微通道對溶液中的生物納米顆粒進(jìn)行多路復(fù)用和分析的方法。該研究提出的微流控芯片可以通過增加獨(dú)立通道的數(shù)量對其進(jìn)行擴(kuò)展以實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的器件設(shè)計(jì)。因此，微流控器件的大小和復(fù)雜程度將成為多路復(fù)用的最終限制因素。不過，作為一種補(bǔ)充途徑，該研究提出的平臺也完全兼容單分子熒光讀出方法，因此可以與最先進(jìn)的熒光標(biāo)記抗體或aptamer文庫相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模單顆粒分析。展望未來，將該研究提出的光流控平臺與片上標(biāo)準(zhǔn)加入法和改進(jìn)的表面鈍化技術(shù)相結(jié)合，就能根據(jù)選定的疾病生物標(biāo)志物對疾病進(jìn)行診斷和護(hù)理監(jiān)測。

總之，研究結(jié)果表明，該研究提出的光流控平臺整合了必要的檢測步驟，能以無標(biāo)記的方式對異質(zhì)生物納米顆粒（例如EV）群體進(jìn)行分子級別的分析，并具有單顆粒靈敏度、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的穩(wěn)健性和高度的可重復(fù)性。該平臺的光學(xué)讀出技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對免疫檢測流程的持續(xù)原位監(jiān)測，從而能夠從穩(wěn)健性、樣品制備時間和所得涂層的高質(zhì)量等方面優(yōu)化表面功能化方案。此外，該方法具有通過結(jié)合生物標(biāo)志物群的信息及其對比信息來研究EV潛在異質(zhì)性的能力?？梢灶A(yù)見，在不受顆粒對比度的大小和折射率影響后，這些檢測方法將為在單個EV層面結(jié)合分子指紋、大小和有效物質(zhì)組成信息，從而更好地表征和研究EV的異質(zhì)性鋪平道路。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41467-024-48132-4

審核編輯：劉清