在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究，診斷，醫(yī)藥產(chǎn)品測(cè)試或材料科學(xué)領(lǐng)域的各種光學(xué)顯微鏡應(yīng)用中，圖像處理是最重要的一環(huán)。本文說(shuō)明了在不同應(yīng)用中選擇相機(jī)時(shí)要考慮的幾個(gè)因素：

要在顯微鏡中使用圖像處理，為各種顯微鏡應(yīng)用選擇最合適的組件至關(guān)重要。除顯微鏡本身外，還包括選擇正確的鏡片，照明，濾光片和偏光片，具體取決于所用的染料和對(duì)比方法。最終，相應(yīng)應(yīng)用的特殊要求對(duì)于選擇最合適的顯微鏡相機(jī)和兼容的圖像處理軟件起決定性作用。

1. 單色或彩色相機(jī)

圖1 單色傳感器(左)和帶有拜耳模式濾色器的傳感器(右)

彩色相機(jī)在應(yīng)用中非常靈活，是傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡廣泛領(lǐng)域不可或缺的一部分。包括生物醫(yī)學(xué)和臨床實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及工業(yè)和材料研究中的許多常規(guī)微觀應(yīng)用。

因此，對(duì)于顯微鏡圖像，通常使用彩色相機(jī)。其顏色保真度和顏色再現(xiàn)應(yīng)盡可能準(zhǔn)確，以便能夠可重復(fù)地區(qū)分材料和生物樣品中最精細(xì)的結(jié)構(gòu)。此外，由于彩色照相機(jī)具有高靈敏度，因此在標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡這類光強(qiáng)度較低的應(yīng)用中，也能出色地完成任務(wù)。它們還適用于使用多頻帶濾波器同時(shí)監(jiān)測(cè)和記錄多個(gè)熒光團(tuán)的應(yīng)用。

單色相機(jī)不包含顏色信息，它可提供有關(guān)圖像傳感器亮度值的完整信息。與彩色相機(jī)會(huì)因?yàn)橥ㄟ^(guò)濾色器吸收光能而導(dǎo)致光強(qiáng)損失相比，單色相機(jī)沒(méi)有光強(qiáng)損失。因此單色相機(jī)非常適合不需要顏色信息的復(fù)雜熒光顯微鏡應(yīng)用。

2.傳感器類型(CCD與CMOS)，幀速率，快門(mén)選項(xiàng)

圖2 CMOS傳感器

對(duì)于傳感器類型，主要有基于CCD(電荷耦合器件)和CMOS(互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體)兩大類。CCD和CMOS傳感器都將光(光子)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。但它們二者的技術(shù)設(shè)計(jì)根本不同，因此它們的特性也不同。選擇正確的傳感器類型取決于應(yīng)用。一般來(lái)說(shuō)，CCD傳感器因其低噪聲系數(shù)，高填充因子，強(qiáng)信噪比，圖像色彩保真度以及具有非常高的圖像質(zhì)量而脫穎而出。這些特性使得使用CCD傳感器的相機(jī)成為低光應(yīng)用的理想選擇。但近年來(lái)，COMS的高速(幀速率)和分辨率(像素?cái)?shù))，較低的功耗以及最近改進(jìn)的噪聲特性，動(dòng)態(tài)，量子效率和色彩概念已經(jīng)使它們向包括顯微鏡應(yīng)用在內(nèi)的以前使用CCD傳感器的應(yīng)用開(kāi)放。其中特別是高速度和現(xiàn)代CMOS傳感器的新顏色概念提供了出色的實(shí)時(shí)圖像。

幀速率用來(lái)描述傳感器每秒可以捕獲和發(fā)送的圖像的數(shù)量。幀速率越高，意味著傳感器越快，每秒捕獲的圖像越多，可以傳輸更高的數(shù)據(jù)量。對(duì)于自動(dòng)化應(yīng)用，除了高圖像質(zhì)量之外還需要高吞吐量，因此需要更高的幀速率。例如對(duì)樣品的自動(dòng)掃描，用于自動(dòng)聚焦或多個(gè)圖像在短時(shí)間內(nèi)完整再現(xiàn)的應(yīng)用。

相機(jī)快門(mén)僅在曝光時(shí)打開(kāi)，選擇合適的曝光時(shí)間以提供所需的光通量。主要有全局快門(mén)和滾動(dòng)快門(mén)兩種選項(xiàng)。CCD傳感器始終使用全局快門(mén)，而CMOS傳感器則提供兩種型號(hào)。兩種快門(mén)之間的區(qū)別在于傳感器曝光圖像的方式：對(duì)于全局快門(mén)，整個(gè)傳感器同時(shí)暴露，這意味著光線同時(shí)照射到傳感器的整個(gè)表面。具有滾動(dòng)快門(mén)的傳感器則以快速的時(shí)間順序(在幾微秒內(nèi))逐個(gè)單元地逐步曝光。比全局快門(mén)相比，帶有滾動(dòng)快門(mén)的傳感器由于讀出噪聲低，具有更高的動(dòng)態(tài)范圍。高動(dòng)態(tài)性允許高質(zhì)量地記錄和分析詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。但在樣品/樣品臺(tái)的非常快速移動(dòng)期間或在曝光期間物體的移動(dòng)可能導(dǎo)致失真，被稱為滾動(dòng)快門(mén)效應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)使用特定限制內(nèi)的曝光時(shí)間來(lái)防止?jié)L動(dòng)快門(mén)效應(yīng)。

3.分辨率，像素點(diǎn)大小和傳感器尺寸

圖3 由不同像素?cái)?shù)相機(jī)記錄的同一圖像

相機(jī)傳感器的分辨率是指?jìng)鞲衅魃系南袼財(cái)?shù)。例如，某相機(jī)具有500萬(wàn)像素的分辨率，意味著光學(xué)系統(tǒng)投射到該傳感器上的圖像被分解為500萬(wàn)像素點(diǎn)。對(duì)于顯微鏡相機(jī)，顯微鏡中相機(jī)的像素分辨率應(yīng)高于鏡頭的光學(xué)分辨率，建議像素分辨率至少是鏡頭光學(xué)分辨率的三倍。例如，若需要較低的放大倍率，則需要具有相應(yīng)高分辨率的相機(jī)，以實(shí)現(xiàn)顯微圖像的所有細(xì)節(jié)的理想記錄和再現(xiàn)。根據(jù)應(yīng)用的不同，300萬(wàn)到500萬(wàn)像素通常就足夠了。因?yàn)橛捎诠鈱W(xué)系統(tǒng)的限制，更高的分辨率通常不會(huì)提供任何附加圖像信息。

像素點(diǎn)大小也很重要。通常對(duì)于單色及彩色傳感器，像素最小分別為5μm和2.5μm是合理的選擇。

圖4 常見(jiàn)的傳感器尺寸(一英寸約等于16毫米)

對(duì)于顯微鏡相機(jī)來(lái)說(shuō)，傳感器的尺寸通常在1/3“到1”之間。應(yīng)該比鏡頭的視場(chǎng)直徑略小，以便可以以理想清晰度再現(xiàn)傳感器圖像的所有區(qū)域。

圖5

最常見(jiàn)的用于微觀應(yīng)用的是具有4:3橫縱比的傳感器。

4.冷卻CCD/CMOS傳感器與非冷卻傳感器

任何傳感器都會(huì)產(chǎn)生暗噪聲或暗電流：熱量在傳感器芯片上的像素中產(chǎn)生電子，其與由光產(chǎn)生的電子混合，引起干擾以覆蓋所需的圖像信息使圖像內(nèi)容失真。暗電流和噪聲與傳感器溫度成正相關(guān)，在運(yùn)行期間，傳感器溫度增加會(huì)導(dǎo)致更大的噪聲。通過(guò)冷卻傳感器可以減少暗電流。假設(shè)圖像信號(hào)保持不變，將傳感器溫度降低7°C可降低約一半暗電流。

通常非冷卻傳感器能夠滿足大部分應(yīng)用，但如果在較弱的照明條件下需要特別長(zhǎng)的曝光時(shí)間，或者如果圖像分析或進(jìn)一步處理需要特別恒定且可重復(fù)的結(jié)果，則冷卻傳感器是正確的選擇。例如體內(nèi)生物發(fā)光應(yīng)用或天文學(xué)中的應(yīng)用。

5.總結(jié)：

如果要使用彩色相機(jī)，請(qǐng)確保相機(jī)提供顏色配置。對(duì)于復(fù)雜的熒光應(yīng)用，考慮使用單色相機(jī)產(chǎn)生較少的噪音。如果要以低放大倍率再現(xiàn)大部分樣品，請(qǐng)選擇高分辨率。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡應(yīng)用，幀速率較低的相機(jī)通常能夠滿足需要。使用合適的軟件可以顯著提高圖像質(zhì)量，始終使用相機(jī)的最新軟件版本。

審核編輯 黃宇