近日，中科院長春光機所應(yīng)用光學(xué)國家重點實驗室利用微流控技術(shù)，將微滴生成、PCR擴(kuò)增和熒光檢測等環(huán)節(jié)進(jìn)行集成，運用連續(xù)流動式PCR擴(kuò)增方法，實現(xiàn)了“樣本進(jìn)、結(jié)果出”的一體化數(shù)字PCR系統(tǒng)。

數(shù)字PCR也叫Digital PCR（dPCR），是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。相較于傳統(tǒng)熒光定量PCR(qPCR)來說，dPCR對結(jié)果的判定不依賴于擴(kuò)增曲線循環(huán)Ct值，不受擴(kuò)增效率的影響，能夠直接讀出DNA的分子個數(shù)，是對起始樣本核酸分的子絕對定量。dPCR一般包括三部分內(nèi)容，即樣本離散、PCR擴(kuò)增和熒光信號分析。與傳統(tǒng)技術(shù)不同，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬個單元。每一個反應(yīng)單元獨立進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。不同于qPCR對每個循環(huán)進(jìn)行實時熒光測定的方法，dPCR技術(shù)是在擴(kuò)增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集。最后通過直接計數(shù)或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。針對這一檢測流程，提出了一種連續(xù)流動式、全自動、一體化集成數(shù)字PCR系統(tǒng)，只需要一次進(jìn)樣就可同步實現(xiàn)微液滴生成、熱循環(huán)擴(kuò)增以及核酸絕對定量分析的整個dPCR檢測流程。

圖1 數(shù)字PCR原理及檢測過程

如圖2所示該系統(tǒng)主要由液滴生成及流體驅(qū)動裝置、PCR擴(kuò)增芯片及溫度控制裝置、數(shù)字液滴熒光檢測裝置組成。雙路高精度注射泵驅(qū)動水相與油相液體經(jīng)Y型液滴生成裝置，產(chǎn)生包裹有單分子級別DNA的液滴；液滴沿Teflon管道連續(xù)流過多個恒溫加熱區(qū)，從而實現(xiàn)DNA的擴(kuò)增；利用470 nm光源激發(fā)反應(yīng)后液滴內(nèi)的熒光探針，并由CMOS進(jìn)行信號的捕捉。該系統(tǒng)將全部檢測流程集成于一臺設(shè)備內(nèi)，由鋰電系統(tǒng)為整個系統(tǒng)供能，并設(shè)計了相配套的上位機控制及數(shù)據(jù)分析軟件。與傳統(tǒng)由多臺設(shè)備共同組成的dPCR檢測系統(tǒng)不同，該系統(tǒng)無需在實驗中途進(jìn)行人工樣本轉(zhuǎn)移等操作，只需將待檢測樣本加入該系統(tǒng)，就可得到樣本的定量檢測結(jié)果。

圖2 系統(tǒng)組成示意圖

研究團(tuán)隊利用該系統(tǒng)完成了人體血清內(nèi)HBV病毒的定量檢測，對病毒濃度為

103- 105IU/mL的血清樣本進(jìn)行測試，其液滴熒光強度分布與分布頻率如圖3所示，可以看出，隨模板濃度逐漸增高，其陰性液滴占比也逐漸減少。如圖4所示，液滴統(tǒng)計結(jié)果通過泊松分布校正，可計算出模板中DNA分子的絕對濃度，并與商用定量PCR儀結(jié)果進(jìn)行比較，從圖5可以看出，其結(jié)果具有很強的線性相關(guān)度，經(jīng)多次重復(fù)實驗驗證，檢測結(jié)果具有較高的可重復(fù)性和定量精度。

圖3 (a-c)液滴熒光強度分布及頻率分布 (d)液滴熒光圖像

圖4 樣本濃度檢測結(jié)果

圖5 dPCR與qPCR檢測結(jié)果的比較

綜上所述，該系統(tǒng)具有較高的集成度和自動化程度，在便攜性和操作難易程度上具有一定的優(yōu)勢，為現(xiàn)場檢測奠定了基礎(chǔ)。該系統(tǒng)在低水平病原體檢測、病毒載荷絕對定量、罕見等位基因檢測、拷貝數(shù)變異分析等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。相關(guān)工作以“Fully automatic integrated continuous-flow digital PCR device for absolute DNA quantification”為題發(fā)表于《Analytica Chimica Acta》。