近日，哈爾濱工業(yè)大學(xué)儀器學(xué)院青年教授李浩宇團(tuán)隊(duì)在生物醫(yī)學(xué)超分辨顯微成像技術(shù)領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展。針對目前超分辨顯微鏡所面臨的成像通量限制，團(tuán)隊(duì)提出基于計(jì)算光學(xué)成像的新一代高通量三維動態(tài)超分辨率成像方法，通過計(jì)算成像技術(shù)增強(qiáng)熒光漲落探測靈敏度，使探測靈敏度提升兩個數(shù)量級以上，突破了現(xiàn)有顯微成像技術(shù)在高通量視場、高空間分辨率和高時間分辨率等難以兼顧的難題，將目前世界上超分辨顯微鏡中最高通量視場成像范圍提升至毫米級，可在10分鐘內(nèi)對包含超過2000個細(xì)胞的視場上實(shí)現(xiàn)了128納米的超高空間分辨率成像，為細(xì)胞學(xué)異質(zhì)性和生物醫(yī)學(xué)等研究提供新的科學(xué)影像儀器。 ?

? 6月15日，該研究成果以《通過增強(qiáng)熒光漲落檢測實(shí)現(xiàn)高通量超分辨率成像》（Enhanced detection of fluorescence fluctuations for high-throughput super-resolution imaging）為題，以長文形式在線發(fā)表于國際權(quán)威雜志《自然光子學(xué)》（Nature Photonics，2021年影響因子39.7，光學(xué)類最高），這是哈工大首次在該刊物上以第一通訊單位發(fā)表論文。

超分辨成像技術(shù)的出現(xiàn)標(biāo)志著成像領(lǐng)域?qū)τ诠鈱W(xué)衍射極限的突破，也極大地推動了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。利用超分辨技術(shù)，生物學(xué)家得以對病態(tài)細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行精準(zhǔn)的量化統(tǒng)計(jì)和直觀的可視化分析。然而，常見的超分辨技術(shù)往往需要復(fù)雜的圖像采集設(shè)備和特定的成像控制，并且時間分辨率低，成像通量不足，這限制了超分辨成像在生物醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用。

基于熒光漲落物理特性的超分辨成像技術(shù)（Super-resolution optical fluctuation imaging，SOFI）是一種經(jīng)典的基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的超分辨方法，可以在不借助額外光學(xué)元件的條件下突破衍射極限。但傳統(tǒng)的SOFI技術(shù)往往需要1000幀以上的原始圖像用于重建，自2009年提出至今仍然難以滿足生物醫(yī)學(xué)中對于大視場和細(xì)胞器瞬時動態(tài)等研究的高通量成像需求。

為了解決上述問題，李浩宇團(tuán)隊(duì)提出了自相關(guān)兩步解卷積超分辨成像（Super resolution imaging based on Auto Correlation with two-step Deconvolution，SACD）。不同于傳統(tǒng)SOFI需要統(tǒng)計(jì)大量的原始圖像，SACD通過增強(qiáng)圖像中的可探測熒光漲落特性，在每一幀圖像中提取更多有效信息以實(shí)現(xiàn)超分辨成像。SACD在計(jì)算超分辨統(tǒng)計(jì)量前對原始圖像進(jìn)行預(yù)解卷積，這一獨(dú)特的處理增強(qiáng)了熒光信號的開關(guān)對比度，更高效地利用信息，從而縮減了重建所需的原始圖像數(shù)量。隨后再將解卷積作為后處理步驟，進(jìn)一步提升空間分辨率。最終，SACD可以將重建所需原始圖像數(shù)量縮減兩個數(shù)量級以上，并使空間分辨率提升超過兩倍多，滿足了生物醫(yī)學(xué)研究的高通量成像需求。

高通量成像——大視場細(xì)胞骨架微管成像

研究團(tuán)隊(duì)將SACD方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)盤共焦（Spinning Disk Confocal，SDC）系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對毫米級（2毫米×1.4毫米）視場內(nèi)微管的高通量超分辨成像，包含多達(dá)2000個細(xì)胞。傳統(tǒng)SOFI需要幾乎半天的連續(xù)采樣才能對整塊區(qū)域完成重建，而SACD只需10分鐘便可達(dá)到更加優(yōu)越的成像性能。在任意區(qū)域中，SACD都保持了極高的分辨率，能夠清晰地分辨鄰近的微管結(jié)構(gòu)，解析出轉(zhuǎn)盤共焦顯微系統(tǒng)無法得到的高頻信息。

活細(xì)胞長時程成像——活細(xì)胞線粒體外膜動態(tài)成像

為了克服低信噪比與長時程的活細(xì)胞成像條件，李浩宇團(tuán)隊(duì)在SACD的基礎(chǔ)上引入了之前開發(fā)的稀疏解卷積技術(shù)（該團(tuán)隊(duì)于去年發(fā)表在《自然生物技術(shù)》期刊上，Weisong Zhao et al.，Nature Biotechnology，40，606–617，2022）。Sparse-SACD使快速而復(fù)雜的細(xì)胞器動態(tài)過程得以可視化，實(shí)現(xiàn)在超過10分鐘的時間內(nèi)對COS-7活細(xì)胞線粒體進(jìn)行快速動態(tài)成像。得益于該技術(shù)的高通量與穩(wěn)定性，線粒體被解析為中空的膜狀細(xì)胞器，整個細(xì)胞中線粒體的裂變和融合過程都被清晰地記錄下來。

圖為活體四維超分辨成像。轉(zhuǎn)盤共焦顯微鏡（SD-confocal，左）和Sparse-SACD（右）在37°C下對Skylan-S-TOM20標(biāo)記的活COS-7細(xì)胞進(jìn)行四維成像。比例尺：5微米。 最后，研究者使用SACD技術(shù)進(jìn)行了全活細(xì)胞四維超分辨成像，即在超過10分鐘時間（成像溫度37°C）內(nèi)對COS-7活細(xì)胞的線粒體外膜網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行三維超分辨體成像（上圖）。與傳統(tǒng)共焦系統(tǒng)相比，精細(xì)結(jié)構(gòu)的可見性得到了根本性提高，線粒體被清晰地成像為銳利的中空膜結(jié)構(gòu)。通過稀疏性和連續(xù)性的雙重約束，SACD高保真地實(shí)現(xiàn)了隨時間變化的全細(xì)胞線粒體裂變與融合成像。

形象地說，分布在熒光背景中的單個分子波動信號就像“迷霧中閃爍的星星”，SACD在計(jì)算統(tǒng)計(jì)量之前盡可能地消除了這種“迷霧”，以便在真實(shí)的生理環(huán)境下實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的超分辨成像。通過充分利用原始圖像中的熒光漲落信息，SACD打破了現(xiàn)有超分辨技術(shù)的通量限制以及需要特殊光學(xué)控制的設(shè)備限制，同時還能夠直接應(yīng)用于現(xiàn)有商業(yè)化共焦熒光顯微鏡系統(tǒng)（或其他任何熒光系統(tǒng)）中，有助于低成本、高通量地進(jìn)行相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究，有望成為生物學(xué)家分析細(xì)胞結(jié)構(gòu)和瞬態(tài)動力學(xué)的常規(guī)儀器。

值得一提的是，SOFI技術(shù)的發(fā)明者、德國喬治-奧古斯都-哥廷根大學(xué)教授安德雷恩（J.Enderlein）是該工作的審稿人之一。安德雷恩教授表示：“在漲落分析之前進(jìn)行預(yù)解卷積的想法很新穎，非常合理，因?yàn)檫@應(yīng)該是消除虛假漲落的好方法”“使用這種技術(shù)呈現(xiàn)的圖像質(zhì)量非常好”“我認(rèn)為所提出的方法會是更優(yōu)的”。

? 哈工大李浩宇教授和北京大學(xué)陳良怡教授為論文的通訊作者；哈工大助理教授趙唯淞為論文的第一作者，論文共同第一作者還包括北京大學(xué)趙士群副研究員、哈工大博士研究生韓鎮(zhèn)謙和丁相妍，論文的共同通訊作者還包括哈工大丁旭旻教授和北京大學(xué)郭長亮副研究員。哈工大譚久彬院士為論文共同作者和哈工大科研團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人。該項(xiàng)研究成果主要由哈工大儀器學(xué)院和北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院合作完成，哈工大為論文第一通訊單位。

編輯：黃飛

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